等电聚焦电泳测定血清蛋白质等电点
实验五 等电聚焦测蛋白质等电点
实验五等电点聚焦测蛋白质等电点Mangogola等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要进展，其实质就是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。
IEF的关键是得到一定范围内的稳定pH梯度，即找到合适的两性载体。
载体两性电解质是脂肪族多氨基多羧基的同系物和异构物的混合物，其氨基和羧基的比例不同，使pH和pI相异、相近。
经过适当电泳时间后，两性电解质将依等电点递增的次序在支持物中从正极到负极彼此相互衔接，形成一平滑稳定的pH梯度。
蛋白质靠近正极在低于其pI的环境中带正电荷，向负极移动，反之则向相反方向移动，最终停在其pI处。
聚焦在等电点的分子也会不断扩散，一旦偏离等电点分子因pH的改变而重新带上正或负电荷，从而又向pI迁移。
最后测出蛋白质停留位置的pH即为该蛋白质的pH。
一．实验过程1.圆柱体凝胶制备用封口膜将玻管[D4×120mm]的一端封口，将玻管套上橡胶塞放置在支架上，加入凝胶至10cm处（注意摇动玻管，震出底部气泡），轻轻铺上一层双蒸水，放置聚合1h。
凝胶T=%，C=%，共4mL30%Acr，%Bis 1mL10%过硫酸铵双蒸水载体两性电解质样品液（BSA-10mg/mL）样品液（肌红蛋白-5mg/mL）TEMED共作三支管，每管加胶液约2.聚焦电泳在电泳下槽注入%硫酸500mL，将套有橡胶塞的玻璃管插入电泳上槽(注意塞紧所有孔，以防电极液下漏)，加入上槽溶液%乙醇胺约1000mL（注意排除凝胶下表面的气泡，凝胶上下表面都要接触电极液）。
接上电源，正极接酸，负极接碱，恒压160V至电流为0，再继续通电20min。
3.蛋白质染色及等电点测定用注射器向胶管注水取出胶条，测量胶体总长度及肌红蛋白距酸端（碱端）距离。
将其中一胶条放在玻璃板上用刀片切成1cm长的小段，按顺序放入装有2mL10mM的KCl溶液中，浸泡过夜，次日用pH计测每支管中的pH值。
另外两只胶条在三氯乙酸中浸泡，等出现灰色条带时量总长及其距酸端（碱端）距离。
实验一蛋白质的两性反应及等电点的测定2
实验一蛋白质的两性反应及等电点的测定2一、实验目的1、学习蛋白质的两性反应；二、实验仪器pH计、电泳槽、电源、紫外分光光度计、比色皿、恒温水浴箱等。
三、实验原理蛋白质分子中含有大量的离子基团，它们可以接受或释放H+离子，从而表现出两性反应的特征。
根据pH的变化，蛋白质分子的电荷状态和溶解性都会发生改变。
不同蛋白质的两性反应的pH区间有所不同，但都表现出了一定的规律性。
一般来说，蛋白质的等电点（pI）即蛋白质分子带的净电荷等于零时的pH值。
在这个pH值附近，蛋白质分子的溶解度最低。
2、等电聚焦电泳等电聚焦电泳（isoelectric focusing, IEF）是基于蛋白质分子的等电点原理，运用电场作用于溶液中的蛋白质使其向等电点运动，到达等电点时就不再运动，电场作用力为零，从而使蛋白质在等电点处聚焦。
该技术可以高效地将蛋白质分子分离开，并且不产生电荷的副反应。
IEF的缺点是需要高纯度的蛋白质样品和复杂的设备。
四、实验操作1、示范两性反应的现象制备两个100mL的肉汤。
其中一个加入适量的氢氧化钠溶液，并记录溶液的pH值。
将两个溶液放在一起，观察两溶液之间的相互作用。
2、测定牛血清白蛋白（BSA）的pI值将0.1g的BSA溶解于100mL的蒸馏水中，并调整pH至2.0。
加入适量的氢氧化钠溶液，逐渐增加溶液的pH值。
每次变化pH值0.5时，用pH计测定一次溶液的pH值，并记录BSA 对应的电泳距离。
将记录的数据制成曲线图。
由BSA的等电点的定义，等电点的pH值应该是曲线的最低点。
3、等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点（1）样品的制备制备10mL的蛋白质样品，如卵清蛋白（ovalbumin）、BSA、牛血浆血清白蛋白（BSC）、胰岛素等。
将蛋白质样品以蒸馏水稀释至10μg/μL。
（2）样品的前处理a. 加入10μL的pH 3-10缓冲液、10μL的非离子型洗涤剂和80μL的样品。
b. 活化酶处理：在样品中加入基质，辅助样品中蛋白酶的活化。
蛋白质等电点测定
蛋白质等电点测定及性质实验一、目的：了解等电点的意义及其与蛋白质分子聚沉能力的关系。
初步学会测定蛋白质等电点的基本方法，了解蛋白质的性质。
二、原理：固体颗粒在液体中为什么能够带电？当固体与液体接触时，固体可以从溶液中选择性吸附某种离子，也可以是固体分子本身发生电离作用而使离子进入溶液，以致使固液两相分别带有不同符号的电荷，由于电中性的要求，带电外表附近的液体中必有与固体外表电荷数量相等但符号相反的多余的反离子。
在界面上带电外表和反离子形成了双电层的结构。
在两种不同物质的界面上，正负电荷分别排列成的面层。
对于双电层的具体结构，一百多年来不同学者提出了不同的看法。
最早于1879年Helmholz提出平板型模型；1910年Gouy和1913年Chapman修正了平板型模型，提出了扩散双电层模型；后来Stern又提出了Stern模型。
根据O.斯特恩的观点，一部分反离子由于电性吸引或非电性的特性吸引作用〔例如范德华力〕而和外表紧密结合，构成吸附层〔或称紧密层、斯特恩层〕。
其余的离子则扩散地分布在溶液中，构成双电层的扩散层〔或称滑移面〕。
由于带电外表的吸引作用，在扩散层中反离子的浓度远大于同号离子。
离外表越远，过剩的反离子越少，直至在溶液内部反离子的浓度与同号离子相等。
紧密层：溶液中反离子及溶剂分子受到足够大的静电力，范德华力或特性吸附力，而紧密吸附在固体外表上。
其余反离子则构成扩散层。
滑动面：指固液两相发生相对移动的界面，是凹凸不平的曲面。
滑动面至溶液本体间的电势差称为ζ电势。
固体颗粒带电量的大小及测量方式？ζ电势只有在固液两相发生相对移动时才能呈现出来。
ζ电势的大小由Zeta电位表示，其数值的大小反映了胶粒带电的程度，其数值越高说明胶粒带电越多，扩散层越厚。
一般来说，以pH值为横坐标，Zeta电位为纵坐标作图，Zeta电位为零对应的pH值即为等电点。
对于蛋白质分子来说：蛋白质分子的大小在胶粒范围内，约1～100微米。
蛋白质等电点的测定
蛋白质等电点的测定蛋白质是生命体内构成最广泛的一类生物大分子，具有各种生物功能。
在生物体内，蛋白质具有正负电荷，并在不同PH值的溶液中表现出不同的电性质。
蛋白质在pH等于其等电点时，蛋白质的电荷处于中性状态，亦是纯蛋白质最稳定的情况，因此准确测定蛋白质等电点对于分离、纯化和鉴定蛋白质具有重要意义。
本文中将介绍三种测定蛋白质等电点的方法。
方法1. 等电点电泳法等电点电泳法是一种电泳分离方法，利用蛋白质在不同pH值下的电荷变化探测其等电点。
该方法的原理为将蛋白质经过电泳分离，直到电泳缓冲液pH等于蛋白质的等电点，此时蛋白质处于中性带中心。
与常规电泳仪不同的是，该仪器在酸性电极和碱性电极之间加入溶液，以确保酸碱缓冲系统能够维持所需的pH值。
等电点电泳法可以快速而准确地测定蛋白质等电点，但需要特殊仪器和耗时较长，且样品纯度较高。
方法2. 等电聚焦法等电聚焦法是一种电泳技术，利用在连续的pH梯度中，使具有等电点的蛋白质依次停止迁移，从而分离蛋白质。
该方法的原理是，利用蛋白质在不同pH值下的等电点特性，将样品置于pH梯度中，通过电压控制，使蛋白质在等电点处停止迁移，从而实现蛋白质分离。
等电聚焦法具有高分辨率和高分离效率，同时还可以同时分离出等电点相似但分子量不同的蛋白质，但样品量较小，需要特殊仪器和大量控制。
方法3. pH梯度管柱法pH梯度管柱法是一种可溶性蛋白质的标准测定方法，也是等电点法中最广泛应用的方法之一。
该方法的基本原理是，在含有不同pH值的缓冲液梯度的柱子上，蛋白质会在不同的pH值时呈现出不同的电荷状态。
在pH值等于其等电点时，蛋白质处于中性状态，停止迁移。
通过检测蛋白质在不同pH值下的吸收值，可以确定样品的等电点。
pH梯度管柱法的优点包括样品量较大，操作简单，数据可靠，但分辨率较低，需要特殊的柱子。
三种测定蛋白质等电点的方法各有侧重，实验操作难度大小也不同，一般来说，选择合适的测定方法应根据样品特点和实验条件。
等电点聚焦测蛋白质等电点
实验四等电点聚焦测蛋白质等电点宫魁六组200928006841083一、实验原理：等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，IEF实质就是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。
在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极之间逐步建立起稳定的pH梯度，当蛋白质分子或其它两性分子存在于这样的pH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终到达一个使其表面静电荷为0的区带，这时的pH则是这种分子的pI。
聚焦在等电点的分子也会不断地扩散。
一旦偏离其等电点后，由于pH环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI迁移。
因此，这些分子总是处于不断地扩散和抗扩散的平衡之中，在pI处得以“聚焦”。
二、实验仪器和用具：玻璃管（4支）、封口膜、试管架、细长滴管、注射器和长针头、培养皿、刀片、烧杯、微量移液器、圆盘电泳槽及电泳仪三、试剂：0.1M磷酸（500ml）、0.1M氢氧化钠（1000ml）、丙烯酰胺储液、两性载体电解质、TEMED、牛血清蛋白样品（0.5mg/ml）、过硫酸铵（10%）、三氯乙酸（10%）等四、实验步骤：1、先将玻管洗净，用封口膜封的一端垂直放在架上；2、配胶：丙烯酰胺储液0、67ml两性载体电解质0、2mlTEMED 0、004ml牛血清蛋白质样品0、04ml蒸馏水 2.9ml过硫酸铵0.02ml3、用细长滴管加入溶液至10cm高处，胶面上加3—3cm高水层，进行封闭，聚合10—50min，吸出上层水，用滤纸稍微吸取；4、在电泳槽上槽加800ml磷酸，下槽500ml氢氧化钠；5、将管接入电泳槽，要求上端浸入液面，下端不接触下槽底面，注意排除凝胶下表面的气泡；6、接上电源，正极接酸，负极接碱；恒定160v，4h左右，电泳至电流为“0”；7、取胶将聚胶后的含蛋白质样品的凝胶借助注射器针头注水取出；8、量取三条胶的长度；9、pH梯度的测定取KCl溶液分别加入2ml于10只小管中，将欲测pH 梯度的胶条置于玻片上，用刀片切成1cm长的小段，按顺序放入有标号的小管中，盖好盖子，室温下过夜；10、次日用pH计测每只小瓶中浸泡液的pH值。
蛋白质两性性质及等电点的测定
蛋白质两性性质及等电点的测定蛋白质是生物体中极其重要的有机化合物，是构成生物体的基本组成部分之一。
蛋白质具有很多种类和功能，不同的蛋白质在生物体内发挥着不同的作用。
蛋白质的性质也因其结构而异，其中包括两性性质和等电点。
本文将介绍蛋白质的两性性质及等电点的测定。
一、蛋白质的两性性质蛋白质是由多肽链组成的，其分子中含有氨基酸残基。
这些氨基酸残基中的羧基（-COOH）和氨基（-NH2）可以参与酸碱反应，所以蛋白质具有两性性质，能够在不同的pH值下呈现不同的电离状态。
1. 在低pH值下，蛋白质中的羧基处于质子化状态，成为正电荷，而氨基则不受质子化，保持中性。
因此，在低pH值时，蛋白质呈正电荷状态，称为阳离子。
2. 在高pH值下，蛋白质中的氨基受到氢离子的质子化，成为正电荷，而羧基则不受质子化，保持中性。
因此，在高pH值时，蛋白质呈负电荷状态，称为阴离子。
3. 在等电点附近，蛋白质的质子化和去质子化同时发生，羧基和氨基的质子化程度相等，呈中性状态。
此时，蛋白质没有净电荷，称为等电点。
由于蛋白质的两性性质，可以影响其溶解性、折叠构象和相互作用等特性，对其功能和生物学作用具有重要影响。
二、蛋白质等电点的测定等电点是蛋白质具有中性状态的pH值。
测定蛋白质的等电点可以帮助我们了解其溶解性、电动力学性质和酸碱加工过程中的变化。
常用的测定等电点的方法有以下几种：1. pH梯度电泳法：这是一种常用且广泛应用的测定等电点的方法。
在一个pH梯度上进行电泳，当蛋白质离子迁移速率和电场力相等时，达到等电点。
可以通过在梯度上观察蛋白质带的形成和移动情况来确定等电点。
2. 等电聚焦电泳法：这是一种利用电场作用下蛋白质在凝胶上垂直移动的方法，根据蛋白质在凝胶中的移动速率和电场力相等时的pH值来测定等电点。
3. 等电点电位计法：该方法利用等电点时蛋白质没有净电荷的特性，使用电位计测量蛋白质在不同pH值下的电位变化，找出没有净电荷时的pH值，即为等电点。
实验三等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点
实验三等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点一、实验目的了解等电聚焦的原理。
通过蛋白质等电点的测定，掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直管式等电聚焦电泳技术。
二、实验原理等电聚焦（Isoelectric focusing，简称IEF）是六十年代中期出现的新技术。
近年来等电聚焦技术有了新的进展，已迅速发展成为一门成熟的近代生化实验技术。
目前等电聚焦技术已可以分辨等电点（pI）只差0.001pH单位的生物分子。
由于其分辨力高，重复性好，样品容量大，操作简便迅速，在生物化学、分子生物学及临床医学研究中得到广泛的应用。
蛋白质分子是典型的两性电解质分子。
它在大于其等电点的pH环境中解离成带负电荷的阴离子，向电场的正极泳动，在小于其等电点的pH环境中解离成带正由荷的阳离子，向电场的负极泳动。
这种泳动只有在等于其等电点的pH环境中，即蛋白质所带的净电荷为零时才能停止。
如果在一个有pH梯度的环境中，对各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，则在电场作用下，不管这些蛋白质分子的原始分布如何，各种蛋白质分子将按照它们各自的等电点大小在pH梯度中相对应的位置处进行聚焦，经过一定时间的电泳以后，不同等电点的蛋白质分子便分别聚焦于不同的位置。
这种按等电点的大小，生物分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为就称为“等电聚焦”。
等电聚焦的特点就在于它利用了一种称为两性电解质载体的物质在电场中构成连续的pH梯度，使蛋白质或其他具有两性电解质性质的样品进行聚焦，从而达到分离、测定和鉴定的目的。
两性电解质载体，实际上是许多异构和同系物的混合物，它们是一系列多羧基多氨基脂肪族化合物，分子量在300~1000之间。
常用的进口两性电解质为瑞典Pharmacia-LKB公司生产的Ampholine 和Pharmalyte，价格昂贵。
国产的有中国军事医学科学院放射医学研究所和上海生化所生产的两性电解质，价格便宜，质量尚佳。
两性电解质在直流电场的作用下，能形成一个从正极到负极的pH值逐渐升高的平滑连续的pH梯度。
聚丙烯酰胺凝胶平板等电聚焦电泳测定蛋白质等电点
聚丙烯酰胺凝胶平板等电聚焦电泳测定蛋白质等电点一、目的：学习聚丙烯酰胺凝胶平板等电聚焦电泳测定蛋白质等电点的原理及方法。
二、原理：等电点聚焦（isoelectric focusing, IEF）或简称电聚焦（electrof ocusing），也曾称等电点分离聚焦电泳等。
它是60年代中期出现的技术，克服了一般电泳易扩散的缺点。
近年来，等电点聚焦电泳又有了新的进展，可以分辨等电点只差0.001pH单位的生物分子。
由于它的分辨力高、重复性好、样品容量大、操作简便、迅速，在生物化学、分类学、分子生物学及临床医学研究等诸方面，都得到广泛应用。
等电点聚焦电泳产生pH 梯度的方法有两种：一是用两种不同的pH缓冲液相互扩散，在混合区形成pH梯度，此为人工pH梯度。
这种pH梯度不稳定，常用于制备电泳；另一种是利用载体两性电解质在电场作用下形成自然pH梯度。
本实验就是利用载体两性电解质形成的自然pH梯度进行蛋白质样品等电焦聚电泳的。
理想的载体两性电解质应该在其本身的等电点处有足够的缓冲能力和良好的导电性，且分子量要小，组成与被分析样品有所区别，对分析样品无变性作用或发生化学反应。
常用的载体两性电解质是一系列脂肪族多氨基和多羧基类的混合物，即是一系列的异构物和同系物，分子量在300—1000之间，各组分的等电点(pI)既有差异又相接近，pI的范围在2.5—11之间。
合成载体两性电解质的原料是丙烯酸和多乙烯多胺，合成反应如下：R1 和R2为氢或带有氨基的脂肪基。
这一反应的特点是生成众多的异构物和同系物的混合物，而不是均一的化合物。
混合物中各成分的含量、等电点的分布，取决于原材料的性质、比例和合成条件。
目前常用的载体两性电解质的商品有：Ampholine（LKB公司）、Pharmlyte（Phar macia公司）、 Serralyty（Serva公司），近来已有国产商品了。
不同厂家合成的方法不同，电泳的条件也略有不同。
检测蛋白质等电点的方法
检测蛋白质等电点的方法
以下是 8 条关于检测蛋白质等电点的方法：
1. 电泳法呀，哇哦，就像让蛋白质们来一场赛跑！比如在凝胶上，不同的蛋白质会根据它们的电荷特性以不同速度前进，是不是很神奇呀？
2. 盐析法呢，就好像把蛋白质放在一个特殊的“筛子”里，随着盐浓度的变化，能看出它们的沉淀情况，这可是个很妙的方法哟！比如说鸡蛋清遇到盐会发生的变化。
3. 等电聚焦法，嘿，想象一下蛋白质顺着电势梯度找到自己的“专属位置”，多有意思呀！像在专门为它们打造的小天地里各就各位。
4. pH 滴定法，这就像是精确地调整酸碱度来引出蛋白质的神秘反应呀！比如慢慢地滴加酸碱看看会发生什么。
5. 分光光度法，哇塞，通过光的变化来洞察蛋白质的秘密，多酷啊！就像是用光线当钥匙打开蛋白质秘密的大门。
6. 超滤法呢，也好有趣呀，把蛋白质和其他东西分离开，就像在一个大混合物里精准地捞出我们想要的，你说好玩不？就拿混合溶液来试试呀。
7. 离子交换层析法，嘿，这就如同让蛋白质在离子的世界里穿梭筛选，找出它们的归宿，是不是很特别呢！就像在一个离子构建的迷宫里探索。
8. 透析法，哇哦，让蛋白质在膜的两边来回穿梭，想想就很刺激呀！就如同让它们玩一场特殊的“穿越游戏”。
我觉得每一种方法都有其独特之处和魅力呀，关键是能帮助我们更好地了解蛋白质的性质呢！。
等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点
北京来亨科学仪器有限公司销售中心：北京丰台区丰北路甲45号鼎恒中心6A1等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点一、实验原理蛋白质是两性电解质，当Ph>PI 时带负电荷，在电场作用下向正极移动；当PH<PI 时带正电荷，在电场作用下向负极移动；当pH＝PI 时净电荷为零，在电场作用下既不向正极也不向负极移动，此时Ph 就是该蛋白质的等电点。
各种PH 蛋白质的PI 不同，利用各种蛋白质PI 不同，以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体，两性电解质载体在电场作用下，按各自PI 形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的PH 梯度。
北京来亨科学仪器有限公司销售中心：北京丰台区丰北路甲45号鼎恒中心6A 2在电场作用下，蛋白质在此PH梯度凝胶中泳动，当迁移到PH值等于PI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区带，这种分离蛋白质的方法称为聚丙烯酰胺等电聚焦电泳。
聚丙烯酰胺等电聚焦电泳操作简单，电泳时间短，分辨率高。
其应用范围广，可用于分离蛋白质及测定PI，也可用于临床鉴别诊断、农业、食品研究及动物分类等各种领域。
随着其他技术的不断改进，等电聚焦电泳也不断充实完善，从柱电泳发展到垂直板，又继而发展到超薄型水平板电泳等，还可与其他技术或SDS-PAGE结合，进一步提高灵敏度与分辨率。
二、实验用品（一）器材（1）垂直管电泳槽和玻管。
（2）恒压恒流电泳仪。
（3）酸度计（二）试剂（1）凝胶贮液：丙烯酰胺30g,甲叉双丙烯酰胺0.8g,加重蒸水使其溶解后定容至100ml，置棕色试剂瓶中，4℃贮存。
（2）10%TEMED:取10mlTEMED,加重蒸水至100ml,置棕色瓶内，4℃贮存。
（3）5%过硫酸胺：称AP1.0g,加重蒸水至10ml，当天配制。
（4）电极缓冲液。
5%磷酸溶液：量取58.8ml85%磷酸，定容至1000ml。
2%NaOH溶液：称20gNaOH，溶于蒸馏水并定容至1000ml。
北京来亨科学仪器有限公司销售中心：北京丰台区丰北路甲45号鼎恒中心6A 3（5）两性电解质载体PH3~10。
实验报告等电点聚焦测蛋白质等电点
等电点聚焦测蛋白质等电点一．实验目的1.了解蛋白质的两性解离性质和等电点聚焦的原理；2. 学习测定蛋白质等电点的方法并掌握圆盘电泳技术。
二．实验原理等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，IEF实质就是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。
在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极之间逐步建立起稳定的pH梯度，当蛋白质分子或其它两性分子存在于这样的pH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终到达一个使其表面静电荷为0的区带，这时的pH则是这种分子的pI。
聚焦在等电点的分子也会不断地扩散。
一旦偏离其等电点后，由于pH环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI迁移。
因此，这些分子总是处于不断地扩散和抗扩散的平衡之中，在pI处得以“聚焦”。
三．实验步骤1.凝胶制备按表1的比例配制4ml工作胶液，在真空干燥器中抽气10min。
每组4管，每管加胶液1.8ml。
混匀后立即注入到已准备好的凝胶管中，胶液加至离管顶部1cm处，在胶面上再覆盖3mm厚的水层，应注意不要让水破坏胶的表面，室温下放置20～30min即可聚合。
表1 凝胶工作液配比2.电泳吸去凝胶柱表面上的水层，将凝胶管垂直固定于圆盘电泳槽中。
于电泳槽下槽加入0.2％的500ml 硫酸作正极；上槽加入0.5％的800ml 乙醇胺作负极打开电源，将电压恒定为300V ，因为聚焦过程是电阻不断加大的过程，故聚焦电泳过程中，电流将不断下降，降至稳定时，即表明聚焦已完成，继续电泳约30min 后，停止电泳，全程约需3h 。
3.剥胶电泳结束后，取下凝胶管，用水洗去胶管两端的电极液，按照柱状电泳剥胶的方法取出胶条，以胶条的正极为“头”，负极为“尾”，正极端呈酸性，负极端呈碱性。
剥离后，量出并记录凝胶的长度。
4.固定取其中的凝胶条3根置于一个小培养皿内，倒入10%放在三氯乙酸固定液中固定，约半小时后，即可看到胶条内蛋白质的白色沉淀带。
蛋白质等电点名词解释
蛋白质等电点名词解释蛋白质等电点是指蛋白质分子在溶液中的电离状态下，其总电荷为零的pH值。
蛋白质是由氨基酸组成的，而氨基酸分子中含有两个离子化的基团：胺基(-NH2)和羧基(-COOH)。
当蛋白质分子处于酸性环境时，其羧基会失去H+而呈阴离子状态；而在碱性环境中，胺基会捕获H+而呈阳离子状态。
因此，蛋白质分子在不同的pH值下会处于不同的电离状态。
蛋白质分子的电离状态会直接影响其生物功能和结构稳定性。
蛋白质分子有时具有特定的电荷分布，这对于其正常功能的发挥是非常重要的。
例如，酶作为一种特殊的功能蛋白质，其催化活性往往与特定的电荷状态有关。
此外，蛋白质的电离状态也与其在溶液中的溶解度和聚集状态有关，进而影响其在细胞内的运输和储存。
蛋白质等电点（pI）是指当蛋白质分子的总电荷为零时的pH 值。
在此pH值下，蛋白质分子的羧基和胺基的离子化程度相等。
蛋白质的pI值可以通过测定其电荷分布和pH值的关系来确定。
在酸性环境中，蛋白质的总电荷倾向于阳离子状态，pH值小于pI；而在碱性环境中，蛋白质的总电荷倾向于阴离子状态，pH值大于pI。
对于某些蛋白质分子来说，其pI值的确定将有助于预测其在不同pH环境下的电离状态和溶解度。
例如，可以通过比较蛋白质的等电点和给定溶液的pH值，来判断蛋白质在该溶液中的离子化状态和溶解度。
根据蛋白质的等电点和其他物质的pH差异，还可以通过等电聚焦等电点电泳等方法对蛋白质进行分离和纯化。
总之，蛋白质等电点是指在溶液中，蛋白质分子的总电荷为零的pH值。
蛋白质的电离状态和等电点对于其结构、功能和溶解度具有重要的影响，了解蛋白质的等电点有助于深入理解和研究蛋白质的生物学特性。
实验七等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点
以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持介质，并在凝胶中加 入两性电解质载体，在电场作用下，蛋白质在此pH梯 度的凝胶中泳动，当迁移至pH值等于pI处时，就不再 泳动，而被浓缩成狭窄的区带。
• 两性电解质载体(carrier ampholytes) (1) 易溶于水，在 pI 处应有足够的缓冲能力，形成稳 定的pH梯度，不致被蛋白质或其它两性电解质改变 pH梯度。 (2) 在 pI 处应有良好的电导及相同的电导系数，以保 持均匀的电场。 (3) 分子量小，可通过透析或分子筛法除去，便于与 生物大分子分开。 (4) 化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，也无 变性作用，其化学组成不同于蛋白质。
5 .蛋白质条带聚焦位置的计算
求出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度为： 蛋白区带中心距凝胶条正极端的距离 固定染色前凝胶条长度 固定染色后凝胶条长度
6. pH梯度的制作
取已知等电点的标准蛋白聚焦凝胶条放在玻板 上，量出各蛋白条带至正极端的实际长度，以条带 实际长度为横坐标，对应的 pH 值为纵坐标，绘制标 准pH梯度曲线。
3．剥胶
电泳结束后，取下凝胶管，用蒸馏水洗净两端电极液，在 凝胶条的正极端作上标记。用灌满水的注射器长针头插入凝胶 与玻管管壁之间，边压水边慢慢转动玻管，推针前进，同时注 入水，靠水流压力和润滑力将玻璃管内壁与凝胶分开，凝胶条 即可流出。
4 .固定染色
取出凝胶条放在一块洁净的玻板上，用尺量出固定前的凝 胶条长度。放入带盖试管中加入固定液。固定 20min2 后，倒 掉固定液后用脱色液漂洗 2次，再染色 1h，用蒸馏水漂洗数次 后用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，量出蛋白带距正极端 的距离。
图 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图 (A为正面,B为剖面)
四、操作方法 1. 凝胶柱的制备
血清蛋白等电点
血清蛋白等电点
血清蛋白的等电点是指在酸碱平衡下，蛋白质在溶液中呈电中性的pH值。
等电点是指蛋白质带有净电荷的平均电荷为零的pH值。
血清蛋白是血液中含有的各种蛋白质的总称，包括白蛋白、球蛋白、纤维蛋白等。
不同的血清蛋白具有不同的分子结构和氨基酸组成，因此它们的等电点也不同。
血清蛋白的等电点可以通过实验方法或计算方法来确定。
一种常见的实验方法是等电聚焦（isoelectric focusing），利用电场将蛋白质在凝胶中移动，直到它们达到零电荷状态。
这样，通过测量最终停止迁移时的pH值，可以确定血清蛋白的等电点。
另一种计算等电点的方法是基于蛋白质的氨基酸序列和对应的pKa值。
每种氨基酸都有特定的pKa值，表明该氨基酸在溶液中的酸碱性质。
通过计算氨基酸组成和对应pKa值，可以预测血清蛋白的等电点。
血清蛋白的等电点对于了解其电荷性质和在体内功能的理解具有重要意义。
在特定pH值下，蛋白质可能表现出特定的生理功能、相互作用和电泳行为。
因此，研究血清蛋白的等电点可以有助于深入了解其在健康和疾病状态下的变化和作用。
肝病患者血清蛋白质等电点聚焦电泳分析
肝病患者血清蛋白质等电点聚焦电泳分析卢艳如;褚燕君【期刊名称】《河南医学研究》【年(卷),期】1994(3)2【摘要】本文首次运用敏感性较高的聚丙烯酰胺等电点聚焦（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃｆｏｃｕｓｉｎｇ，ＩＥＦ）电泳技术对肝病患者的血清蛋白质谱进行分析。
结果表明，正常人及各型肝病患者血清中含有等电点不同的蛋白质３８～４３种，以肝硬化患者为最少。
蛋白质成分中以酸性蛋白（ＰＩ＜６．５）占优势（５５．００％～６１．９０％）。
乙肝病毒携带者的血清蛋白质谱接近正常人，二者与各型肝病之间存在着较大差异；原发性肝癌患者与慢性活动性肝炎患者的血清蛋白质谱差异率（７．１４％），显著低于（Ｐ＜０．０５）其与肝硬化患者之间的差异率（１２．５０％），亦显著低于（Ｐ＜０．０１）其与慢性迁延性肝炎患者的差异率（１７．０７％），此结果提示慢性活动性肝炎与原发性肝癌的蛋白质谱比肝硬化与原发性肝癌的蛋白质谱更为接近。
在慢性活动性肝炎患者血清中发现了等电点（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃｐｏｉｎｔ，ＰＩ）７．３０的特征性蛋白质，这一蛋白质的确切成分及其在慢性活动性肝炎诊断上的价值有待进一步探讨。
【总页数】4页(P128-131)【作者】卢艳如;褚燕君【作者单位】不详;不详【正文语种】中文【中图分类】R575【相关文献】1.全柱成像毛细管等电聚焦电泳分析蛋白质药物电荷异质性 [J], 孟晓光;甄里;刘悦玫;侯利平;刘丹;李斌;欧阳伟民;魏开华2.肝病患者血清蛋白电泳分析 [J], 郭晓霞;梁瑞敏3.一步法和两步法毛细管等电聚焦测定蛋白质和多肽等电点的比较 [J], 高培峰;赵新颖;贺木易;刘庆生;屈锋4.固化pH梯度毛细管等电聚焦整体柱的制备及在蛋白质等电点分析中的应用 [J], 刘让东; 许歆瑶; 王薇薇; 王彦; 闫超5.卫氏并殖吸虫二倍体型和三倍体型虫体蛋白的等电点聚焦电泳分析 [J], 陈蓉;李得垣因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
等电聚焦电泳的电压
等电聚焦电泳的电压
等电聚焦电泳是一种蛋白质电泳技术，用于分离和检测蛋白质。
在等电聚焦电泳中，蛋白质被分离成具有不同电荷和大小的带电分子，这些带电分子在电场中沿着凝胶移动。
在等电聚焦电泳中，电压是一个非常关键的参数。
电压的大小直接影响着蛋白质的分离效果和检测灵敏度。
通常情况下，等电聚焦电泳的电压范围为100V到500V，具体电压的选择取决于凝胶类型、蛋白质的大小和待测样品的性质等因素。
在进行等电聚焦电泳实验时，电压应该逐步增加，以便找到最佳的分离效果和检测灵敏度。
此外，为了确保实验的准确性和可重复性，电压应该在每次实验中保持一致。
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等电聚焦电泳测定血清蛋白质等电点
【实验原理】
等电聚焦电泳是利用具有pH梯度的两性电解质为载体，分离等电点(pI)不同的蛋白质等两性分子的电泳技术。
在IEF电泳系统中，具有一个从阳极到阴极，pH值逐渐增大的连续而稳定的pH梯度，处于此系统的各种蛋白质分子，将根据各自的pI值与所处位点的pH值的差别带上正电或负电。
当蛋白质分子向相反电极移动的过程中，其逐渐靠近与其DI相同的pH位点，直至到达pH=pI，净电荷为零而停止移动，从而达到聚焦。
因此，将pI不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一段时间后，各组分会分别聚焦在各自pI相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带。
根据电泳装置的不同，IEF可分为管型IEF和平板型IEF，本实验介绍管犁PAGE—IEF．
【试剂与器材】
1．凝胶贮备液称取丙烯酰胺(Acr)20g，甲叉双丙烯酰胺(Bis)0．8g，蒸馏水溶解后定容至100mL，过滤，将未溶物滤去，盛于棕色瓶中，4℃冰箱保存。
2．1％(V/V)TEMED溶液。
3．5g/L过硫酸铵称取过硫酸铵0．5g，溶于蒸馏水100mL，冰箱存放，每周新配。
4．40％两性电解质载体。
5．0．5mmol/L磷酸溶液量取85％磷酸16mL，加蒸馏水定容至500mL。
6．0．5mmol/L NaOH溶液称取NaOH10g，加蒸馏水溶解并定容至500mL。
7．1g/L考马斯亮蓝固定染色液称取考马斯亮蓝R250 lg，溶于含甲醇200mL、乙酸100mL和蒸馏水700mL的混合液中，过滤后备用。
8．酸性乙醇脱色液乙醇25份，蒸馏水25份，冰醋酸8份，混匀备用。
9．血清样本血清无须稀释，但最好透析去除离子。
10．电泳仪选用电子管或晶体管整流电源，电压0~600V，电流0~300mA。
11．电泳槽圆盘电泳槽及电泳玻管。
12．锥形瓶，250px长针头或腰椎穿刺针头，5mL或10mL注射器。
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【操作步骤】
1．凝胶制备取洁净干燥的电泳玻璃管2支，将管底用胶布封闭，垂直放置在电泳管架上。
取一锥形瓶，分别加入凝胶贮存液2mL，两性电解质载体0．4mL，1％TEMED溶液2mL，人血清2μl，蒸馏水2．58mL，轻轻搅匀，注意勿带入气泡。
立即用滴管将此凝胶溶液加入上述玻璃管中，直至距上端25px处为止，然后小心加入蒸馏水(3～5mm高)，注意保持凝胶表面平坦，以保证凝胶正常聚合。
室温中静置1小时，让凝胶完全聚合。
此时，凝胶浓度为3．8％，两性电解质载体含量为2％。
2．聚焦将聚合完毕的各凝胶管上端水层吸去，除去下端胶布。
垂直插入圆盘电泳槽装置中。
下槽加入0．5mmol/LNaOH溶液，接负极；上槽加入0．5mmol/L磷酸溶液，接正极。
凝胶管上下端均不得产生气泡，如有气泡，可用针头或细玻棒驱除。
打开电泳仪开关，调至100V处，待电压稳定后调至150~160V，电泳4小时可完成聚焦。
3．剥胶取下凝胶管，先用蒸馏水充分洗涤凝胶管两端，再用带长针头的注射器吸满
蒸馏水，将针头小心插入胶柱与管壁之间，边注水边缓慢旋转玻管，并将针头向前慢慢推进，靠水流压力和润滑力将玻管内壁与凝胶分开，然后用洗耳球在胶管一端轻轻加压，凝胶柱便缓缓从玻管中滑出，将其放在洁净的玻板上，在一端做上标记。
4．固定、染色将凝胶柱平放于玻板上，量取并记录其长度后立即浸入预热到60℃的lg/L考马斯亮蓝固定染色液中约30分钟，取出后用蒸馏水洗涤，再用酸性乙醇脱色液漂洗，洗去背景颜色。
凝胶柱经固定染色后其长度会发生变化，未经固定染色的凝胶柱长度与固定染色后凝胶柱长度之比为变形系数。
量取并记录固定染色后凝胶柱的长度和蛋白质区带中心至正极端的距离，此距离乘以
变形系数，即得该蛋白区带在未经固定染色时凝胶柱上的真实长度。
然后查pH梯度曲线，即可求得该蛋白质的pI。
5．DH梯度的测定将未经固定染色液处理的凝胶柱1根，用蒸馏水充分洗净两端的电极液后，置于干净的培养皿中，培养皿下方垫一张有分度的坐标纸。
先量出凝胶柱长度，再按坐标纸上的分度用刀片依次切成5mm长的小段，由正极开始，依次放入盛有lmL蒸馏水的小试管内浸泡，4℃冰箱过夜。
次日取出平衡至室温，用酸度计测定每管浸提液的pH值。
【结果计算】
以凝胶长度为横坐标，pH值为纵坐标，在坐标纸上绘制出凝胶柱上的pH梯度曲线。
依次由正极开始分析不同pH处的蛋白质，表示该蛋白质的pH值。
【注意事项】
1．由于蛋白质分子的扩散、对流等作用，往往会使已聚焦分离的蛋白质区带重新混合。
为了获得较好的等电聚焦分辨率，在电泳管中必须有抗对流的支持介质以降低样品的扩散作用，一般采用的介质有聚丙烯酰胺、蔗糖等。
2．应选用纯度高的试剂，如Acr和Bis中含有丙烯酸，则会引起聚焦后pH梯度漂移。
3．应根据被测物大概的pI范围选择所需的两性电解质载体。
两性电解质在凝胶中的终浓度一般为1％～3％。
4．盐类干扰pH梯度的形成，造成区带扭曲，因此含盐标本应预先透析或用SephadexG25等除盐。
5．用浸泡法测定凝胶pH梯度时，电泳后应尽快剪成小块浸泡，防止大气中CO2对pH的影响。