等电聚焦电泳测定血清蛋白质等电点

等电聚焦电泳测定血清蛋白质等电点

【实验原理】

等电聚焦电泳是利用具有pH梯度的两性电解质为载体，分离等电点(pI)不同的蛋白质等两性分子的电泳技术。在IEF电泳系统中，具有一个从阳极到阴极，pH值逐渐增大的连续而稳定的pH梯度，处于此系统的各种蛋白质分子，将根据各自的pI值与所处位点的pH值的差别带上正电或负电。当蛋白质分子向相反电极移动的过程中，其逐渐靠近与其DI相同的pH位点，直至到达pH=pI，净电荷为零而停止移动，从而达到聚焦。因此，将pI不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一段时间后，各组分会分别聚焦在各自pI相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带。根据电泳装置的不同，IEF可分为管型IEF和平板型IEF，本实验介绍管犁PAGE—IEF．

【试剂与器材】

1．凝胶贮备液称取丙烯酰胺(Acr)20g，甲叉双丙烯酰胺(Bis)0．8g，蒸馏水溶解后定容至100mL，过滤，将未溶物滤去，盛于棕色瓶中，4℃冰箱保存。

2．1％(V/V)TEMED溶液。

3．5g/L过硫酸铵称取过硫酸铵0．5g，溶于蒸馏水100mL，冰箱存放，每周新配。

4．40％两性电解质载体。

5．0．5mmol/L磷酸溶液量取85％磷酸16mL，加蒸馏水定容至500mL。

6．0．5mmol/L NaOH溶液称取NaOH10g，加蒸馏水溶解并定容至500mL。

7．1g/L考马斯亮蓝固定染色液称取考马斯亮蓝R250 lg，溶于含甲醇200mL、乙酸100mL和蒸馏水700mL的混合液中，过滤后备用。

8．酸性乙醇脱色液乙醇25份，蒸馏水25份，冰醋酸8份，混匀备用。

9．血清样本血清无须稀释，但最好透析去除离子。

10．电泳仪选用电子管或晶体管整流电源，电压0~600V，电流0~300mA。

11．电泳槽圆盘电泳槽及电泳玻管。

12．锥形瓶，250px长针头或腰椎穿刺针头，5mL或10mL注射器。

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【操作步骤】

1．凝胶制备取洁净干燥的电泳玻璃管2支，将管底用胶布封闭，垂直放置在电泳管架上。取一锥形瓶，分别加入凝胶贮存液2mL，两性电解质载体0．4mL，1％TEMED溶液2mL，人血清2μl，蒸馏水2．58mL，轻轻搅匀，注意勿带入气泡。立即用滴管将此凝胶溶液加入上述玻璃管中，直至距上端25px处为止，然后小心加入蒸馏水(3～5mm高)，注意保持凝胶表面平坦，以保证凝胶正常聚合。室温中静置1小时，让凝胶完全聚合。此时，凝胶浓度为3．8％，两性电解质载体含量为2％。

2．聚焦将聚合完毕的各凝胶管上端水层吸去，除去下端胶布。垂直插入圆盘电泳槽装置中。下槽加入0．5mmol/LNaOH溶液，接负极；上槽加入0．5mmol/L磷酸溶液，接正极。凝胶管上下端均不得产生气泡，如有气泡，可用针头或细玻棒驱除。打开电泳仪开关，调至100V处，待电压稳定后调至150~160V，电泳4小时可完成聚焦。

3．剥胶取下凝胶管，先用蒸馏水充分洗涤凝胶管两端，再用带长针头的注射器吸满

蒸馏水，将针头小心插入胶柱与管壁之间，边注水边缓慢旋转玻管，并将针头向前慢慢推进，靠水流压力和润滑力将玻管内壁与凝胶分开，然后用洗耳球在胶管一端轻轻加压，凝胶柱便缓缓从玻管中滑出，将其放在洁净的玻板上，在一端做上标记。

4．固定、染色将凝胶柱平放于玻板上，量取并记录其长度后立即浸入预热到60℃的lg/L考马斯亮蓝固定染色液中约30分钟，取出后用蒸馏水洗涤，再用酸性乙醇脱色液漂洗，洗去背景颜色。

凝胶柱经固定染色后其长度会发生变化，未经固定染色的凝胶柱长度与固定染色后凝胶柱长度之比为变形系数。量取并记录固定染色后凝胶柱的长度和蛋白质区带中心至正极端的距离，此距离乘以

变形系数，即得该蛋白区带在未经固定染色时凝胶柱上的真实长度。然后查pH梯度曲线，即可求得该蛋白质的pI。

5．DH梯度的测定将未经固定染色液处理的凝胶柱1根，用蒸馏水充分洗净两端的电极液后，置于干净的培养皿中，培养皿下方垫一张有分度的坐标纸。先量出凝胶柱长度，再按坐标纸上的分度用刀片依次切成5mm长的小段，由正极开始，依次放入盛有lmL蒸馏水的小试管内浸泡，4℃冰箱过夜。次日取出平衡至室温，用酸度计测定每管浸提液的pH值。

【结果计算】

以凝胶长度为横坐标，pH值为纵坐标，在坐标纸上绘制出凝胶柱上的pH梯度曲线。依次由正极开始分析不同pH处的蛋白质，表示该蛋白质的pH值。

【注意事项】

1．由于蛋白质分子的扩散、对流等作用，往往会使已聚焦分离的蛋白质区带重新混合。为了获得较好的等电聚焦分辨率，在电泳管中必须有抗对流的支持介质以降低样品的扩散作用，一般采用的介质有聚丙烯酰胺、蔗糖等。

2．应选用纯度高的试剂，如Acr和Bis中含有丙烯酸，则会引起聚焦后pH梯度漂移。

3．应根据被测物大概的pI范围选择所需的两性电解质载体。两性电解质在凝胶中的终浓度一般为1％～3％。

4．盐类干扰pH梯度的形成，造成区带扭曲，因此含盐标本应预先透析或用SephadexG25等除盐。

5．用浸泡法测定凝胶pH梯度时，电泳后应尽快剪成小块浸泡，防止大气中CO2对pH的影响。