重组人促红细胞生成素的生产与应用

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重组人促红细胞生成素的生产与应用

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重组人促红细胞生成素的生产与应用任雅怡3090102202

摘要重组人促红细胞生成素是成功应用于生物医药领域的重组蛋白药物产品。科研领域对其性质和合成方法已有了成熟的了解。工业生产者也早已开始大量生产重组人促红细胞生成素，并且取得了不俗的市场成效。

关键词重组人促红细胞生成素生产工艺应用市场开发

重组人促红细胞生成素的性质

促红细胞生成素（erythropoietin,简称EPO）最早于1906年被发现。EPO 属唾液糖蛋白激素，由165个氨基酸组成，为人体内源性化合物，糖基化位点为Asn24、Asn28、Asn83和Ser126,有2对半胱氨酸组成的二硫键(Cys7-Cys61和Cys29-Cys33)，分子量为34～36 ku (SDS-PAGE)、30.4 ku(超滤)或60 ku （凝胶电泳），疏水性极强,pI为3.75~4.15。它主要来源于肾脏（少量来源于肝脏），由皮质管周围的间质细胞合成。

由基因重组技术合成的rhEPO相对分子质量为30400道尔顿，为含165个HYPERLINK "/92666/" \t "_blank" HYPERLINK "/225210/" \t "_blank" 氨基酸糖的酸性糖蛋白，由哺乳动物细胞培养产生，结构与天然EPO极为相似，其理化性质和生物学活性与天然内源性红细胞生成素相同。其不同点是基因位点在7号染色体。在基因重组技术诞生前，EPO主要从贫血患者的尿和绵羊血中提取，提取率非常低，且极不稳定，理化和生物性质难以测定。1985年，人EPO基因克隆和表达的成功，使rh-EPO的制备成为现实。

重组菌构建过程

重组人红细胞生成素，是以重组DNA技术生产的红细胞生成素，将红细胞生成素的基因连接到表达载体上，转化CHO细胞，从细胞培养上清液中纯化得到红细胞生成素。重组人红细胞生成素与天然人红细胞生成素具有相同的体内、体外活性，比活基本相当。

Jacob等人从基因文库中克隆并测序了编码红细胞生成素的DNA片段，同时，以核酸探针从λ噬菌体cDNA文库中筛选得到了编码红细胞生成素的cDNA 片段，以此构建了SV40病毒启动子驱动表达的载体，在猴肾纤维母细胞COS-1中进行瞬时表达，测得了红细胞生成素的生物活性。Lin等人(1985)由人基因组中获得编码红细胞生成素的基因，将其转入中国仓鼠卵巢细胞系（CHO）中，获得稳定的表达。 Quelle等人利用昆虫SF9细胞中的杆状病毒系统表达rhEPO。虽然经转化的SF9细胞生产的rhEPO的产率有所改善，但是目标产物rhEPO的糖基化程度较天然红细胞生成素为小，因而其分子量亦较小。Mori等人构建了一个含有干扰素-α基因启动子的rhEPO表达载体，并利用该rhEPO 表达载体转化B细胞白血病BALL-1细胞。经以仙台病毒转染后，转化的B细胞白血病BALL-1细胞比现有技术所得的转化株能产生较高量的rhEPO。重组红细胞生成素在大肠杆菌中也得到表达，但所得rhEPO仅具有体外抗原结合活性。至于家蚕体内的表达系统，也存在糖基化简单，药物在体内稳定性较低、活性较差等问题。在哺乳动物细胞CHO、BHK细胞系统中表达，获得的重组红细胞生成素与天然红细胞生成素相似。故现在工业生产中多采用动物细胞培养表达红细胞生成素进行大规模生产。

重组人促红细胞生成素的生产工艺

1、表达红细胞生成素的细胞系

①构建红细胞生成素表达载体

有两种方式获得编码人红细胞生成素基因。一种是提取胎肝染色体DNA，然后以特异性寡核苷酸为引物，经聚合酶链式反应扩增出人红细胞生成素的基因片段，然后与克隆载体连接，克隆基因。另一种是提取人胎肝mRNA，逆转录合成cDNA文库，进行文库筛选，得到人红细胞生成素基因。

将人红细胞生成素基因与表达质粒重组，导入哺乳动物细胞，经筛选得到表达人红细胞生成素的细胞株。常用的表达载体有这两种质粒带有二氢叶酸还原酶（dhfr）基因，也可以用不含dhfr基因的表达载体。常用的宿主细胞为CHO细胞。构建载体经过筛选后，必须通过测序，确证红细胞生成素的DNA序列及其推导的氨基酸序列是正确的。

②构建表达红细胞生成素的细胞株

以二氢叶酸还原酶缺陷型的中国仓鼠卵巢细胞系（CHO dhfr-）为宿主细胞。将此细胞培养于100 mm培养皿中，待细胞长满至50%～60%时，用无血清细胞培养基淋洗细胞，加入由无血清培养基、表达载体和共转化载体，以及lipofectin组成的共转染混合液，37℃培养4小时。吸出培养基，加入含10%胎牛血清的F12培养基，37℃培养过夜。随后在含青霉素、链霉素及10%胎牛血清的DEME中培养，获得抗性克隆。逐步提高MTX终浓度，筛选抗性克隆。利用酶联免疫分析法确认所得到的细胞表达人红细胞生成素。

2、 CHO细胞培养工艺过程

在获得了能够高效表达目的蛋白的重组细胞株以后，需要解决的问题就是通过培养而大量生产出目的蛋白。常规动物细胞培养的方法是将细胞放在不同的容器中进行培养。如利用转瓶大量培养贴壁细胞或用生物反应器培养贴壁或悬浮细胞。

转瓶培养细胞工艺简单，规模易于扩大，污染易于控制，一直用于疫苗工业的生产，是传统的细胞培养生产工艺。美国Amgen公司是世界上最早获得人红细胞生成素生产和上市的企业，采用的生产工艺即是转瓶培养生产工艺。以下介绍生物反应器培养工艺。

①种子细胞制备

（1）冻存的细胞株37℃水浴复苏，无菌离心，弃去冻存液。

（2）加入适量DMEM培养基（含10%小牛血清）。

（3）37℃二氧化碳培养箱培养，连续传三代。

（4）细胞消化后接种，接种的细胞浓度约为2.5×106个/ml。

② 反应器连续培养

（1）加入纤维素载体片及pH7.0的PBS缓冲液，5L细胞反应器高压灭菌1.5小时。