免疫印迹实验注意事项

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免疫印迹（WB）实验操作具体步骤及详细说明

免疫印迹（WB）实验操作具体步骤及详细说明免疫印迹（WB）实验操作具体步骤及详细说明一、试剂和溶液转印缓冲液：0.025M Tris base , 0.187 M 甘氨酸, 25%甲醇氨基黑溶液：0.1% 酸性黑10B 1×TBST：25mM Tris-HCl ( pH 8.0 ) , 0.2 M NaCl , 0.1%Tween 20 封闭液：TBST 配制的5%牛奶抗体稀释液：TBST 配制的5%牛奶显色系统：ECL 显色二、实验步骤1.电泳：将裂解液进行SDS-PAGE 电泳，80v，30 分钟，120v，90 分钟；2.转膜：PVDF 膜在甲醇中浸泡约30 秒左右，滤纸浸泡在转印缓冲液预湿，半干法转印到PVDF 膜上，10v，150 分钟；3.染色：氨基黑染色5 分钟，甲醇褪去背景色，观察条带；4.膜活化：将PVDF 膜置于甲醇活化1min，用纯水洗膜2 次后再用TBST 洗涤3 次；5.封闭：将膜条置于5%牛奶或2% BSA 中，室温混摇2h；6.一抗孵育：将待检抗体用3%牛奶或2% BSA 稀释到合适浓度（参照抗体说明书，根据客户预实验结果，稀释度上下浮动一个数量级都为正常），将膜放入对应的已稀释待检样品中，置4℃混摇孵育过夜；7.洗涤：取出膜放在TBST 中洗涤3×5min；8.二抗孵育：将膜取出放入稀释好的HRP 标记的二抗（参照二抗说明书进行稀释）中，室温混摇2h；9.洗涤：取出膜放在TBST 中洗涤3×5min；10.ECL 显色：将膜取出放入混匀的ECL 显色液中，孵育3min，将膜取出贴在有荧光角标的胶片上，迅速用保鲜膜包好；11.曝光：把底片放在暗盒中，根据荧光强度分别对X 光胶片作不同时间段的曝光，曝光结束后，将底片取出，1min 显影，30s 清洗，1min 定影，30s 清洗，晾干；12.结果分析：用扫描仪将曝光后的X 光胶片扫描，做后续结果分析。

westernblot法

Western blot，也称为蛋白质印迹或免疫印迹，是一种常用的生物化学技术，用于分析样品中特定蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。

下面是Western blot的基本步骤和注意事项：一、实验步骤蛋白样品制备：从细胞或组织中提取蛋白质样品，常用的方法有细胞裂解、组织匀浆等。

蛋白定量：使用BCA蛋白浓度测定法等对蛋白质样品进行定量，以便后续的Western blot分析。

凝胶电泳：将蛋白质样品在聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，根据蛋白质的大小和电荷进行分离。

转膜：将电泳分离后的蛋白质样品转移到硝酸纤维素膜上，以便进行后续的免疫检测。

免疫检测：使用特异性抗体对转移后的蛋白质样品进行免疫检测，抗体与目标蛋白质结合后，通过显色反应呈现阳性结果。

数据分析：对免疫检测结果进行定量和定性分析，如条带大小、灰度值等。

二、注意事项实验前要充分了解实验原理和操作流程，确保实验的正确性和可行性。

蛋白样品制备过程中要保证细胞或组织充分裂解和匀浆，以获得更纯的蛋白质样品。

在进行Western blot分析前，要对蛋白质样品进行定量，以保证实验结果的准确性。

在转膜过程中，要选择合适的转移缓冲液和转移时间，以保证蛋白质样品的完整转移。

在免疫检测过程中，要选择合适的抗体和显色试剂，以保证免疫检测结果的特异性。

在数据分析过程中，要选择合适的分析方法和软件，以保证数据分析的准确性和可靠性。

总之，Western blot是一种常用的生物化学技术，在蛋白质分析领域具有广泛的应用价值。

在进行Western blot实验时，要严格遵守实验步骤和注意事项，以保证实验结果的准确性和可靠性。

蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项

蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。

收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。

根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。

因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。

BCA法。

2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。

100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。

煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。

煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。

蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。

(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。

两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。

ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。

然后垂直卡在架子上准备灌胶。

（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。

）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。

灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。

免疫印迹实验步骤及问题解决

免疫印迹实验步骤及问题解决一、实验步骤试剂和缓冲液1x RIPA 缓冲液: 50 mM Tris，150 mM NaCl，0.1% SDS，0.5% SDS，1% Triton X-100 或NP40. 1x PBS 缓冲液: 137 mM NaCl，2.7 mM KCl，2.7 mM Na2HPO4，2.7 mM KH2PO4，pH 7.4 BCA或Bradford蛋白分析试剂盒1.5 M Tris缓冲液（pH 8.8）: 90.68 g Tris-HCl to ddH2O，500 ml溶液pH调节到8.81.0 M Tris缓冲液（pH 6.8）: 60.58 g Tris-HCl to ddH2O，500 ml溶液pH调节到6.810% APS: 100 mg AP 溶于1 ml ddH2O。

用前准备10% SDS: 10 g SDS溶于100 ml ddH2O。

1x Tris-甘氨酸电泳缓冲液: 25 mM Tris，230 mM 甘氨酸（pH 8.3），0.1% SDS。

3x SDS蛋白加样缓冲液: 150 mM Tris （pH 6.8），6% SDS，30% 甘油，30 mM EDTA和0.2% 溴酚蓝1x TTBS: 25 mM Tris（pH 7.5）: 0.15 M NaCl，0.05% Tween-20，0.001% 硫柳汞1x 转移缓冲液: 3 g Tris，14.4 g甘氨酸和200 ml甲醇，加ddH2O 到1L样品准备细胞培养样品贴壁细胞去除培养基，用1X PBS冲洗去掉残留培养基加入预冷的400 ul-1 ml 1X RIPA缓冲液/100 mm平皿。

在冰上孵育5-10 min。

完全刮下细胞并转移到在冰上预冷的1.5 ml离心管中。

（可选）充分混匀或超声处理。

4°C下12,000 rpm离心10-15 min并收集上清总蛋白用前需储存在-20°C。

蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项

蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。

收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。

根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。

因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。

BCA法。

2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。

100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。

煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。

(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。

两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。

ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。

然后垂直卡在架子上准备灌胶。

（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。

）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。

灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。

免疫印迹实验注意事项

免疫印迹实验注意事项免疫印迹实验是生物医学领域中最重要的基础实验之一，可以检测特定的蛋白质和分子，用于研究生理和病理过程中的生物分子。

为了保证实验的准确性和可靠性，以下是免疫印迹实验中需要注意的事项：1. 储存和处理试样在进行免疫印迹实验之前，需要仔细储存和处理试样。

对于细胞培养基和组织样本，应该避免过度冻融，避免样本受到氧化和降解的影响。

试样应该储存在低温冰箱中，并尽可能在实验开始前预冷。

2. 准备合适的分离和检测设备合适的离心机、凝胶和电泳设备对于免疫印迹实验的成功非常重要。

离心过程中，需要保持样本中分离的细胞或蛋白质的完整性，同时尽量避免氧化或损伤。

凝胶的选择应该根据需要分离的蛋白质分子量和种类进行选择。

电泳设备需要保证电流稳定和电极的合适排列。

3. 建议选择高质量的抗体在进行免疫印迹实验时，需要选择高质量的抗体。

不同的生物体内，相同的蛋白质可能存在不同的变异和多态性，因此抗体的选择需要根据需要准确分辨出所需的蛋白质。

同时，抗体应该遵循厂家的使用说明，如储存条件，稀释倍数等。

4. 补充合适的实验辅助试剂免疫印迹实验过程中，需要一些特定的试剂，例如离子交换剂、植物血凝素、PI等。

这些试剂可以帮助分离和纯化蛋白质，提高实验的准确性和可靠性。

5. 进行质量控制和质量验证在进行免疫印迹实验时，非常重要的一步就是质量控制和质量验证。

可以通过加入混合蛋白质套餐和验证最佳稀释倍数等方式进行验证。

同时需要多种控制实验如对照组、阴性对照和阳性对照，以及检测实验的灵敏度和特异性。

总的来说，免疫印迹实验是一项艰巨而复杂的实验，需要非常严格的操作和一定的技术水平保证实验的准确性和可靠性。

以上是免疫印迹实验中需要注意的事项，希望对广大科研工作者有所帮助。

western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项

western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项Western blot（免疫印迹）是一种常用的实验技术，用于检测蛋白质的表达水平和鉴定特定的蛋白质。

下面将分别介绍Western blot的实验结论和注意事项。

实验结论：通过Western blot实验可以得出以下结论：1. 确定蛋白质的表达水平：Western blot可以定量检测特定蛋白质在样本中的表达水平，比如癌细胞中的肿瘤抑制因子的表达水平是否下调，通过和对照组的比较可以得出结论。

2. 确定蛋白质的鉴定：Western blot可以用于鉴定特定蛋白质的存在与否，通过与已知目标蛋白的分子量进行比较，可以确定其身份。

3. 确定蛋白质的修饰状态：一些蛋白质在翻译后会发生修饰，如磷酸化、糖基化等，这些修饰状态可能会影响蛋白质的功能。

通过Western blot可以检测修饰状态，并进一步探究其功能。

注意事项：在进行Western blot实验时，有一些注意事项需要遵守，以保证实验的准确性和可靠性：1. 样品制备：样品的制备至关重要，要确保样品蛋白质的完整性和稳定性。

使用磷酸化酶抑制剂、蛋白酶抑制剂等，避免蛋白质在制备过程中被降解。

2. 蛋白质的分离：Western blot一般需要将蛋白质进行SDS-PAGE电泳，要注意合理选择电泳条件和胶液浓度，以达到最佳的蛋白质分离效果。

同时还需要确保样品装载均匀，可与内参蛋白进行标准化。

3. 转膜条件：Western blot的关键步骤是将分离的蛋白质迁移到聚丙烯酰胺薄膜。

转膜条件包括电流、时间和转膜缓冲液的配方，需要根据蛋白质的大小和性质进行优化，以确保迁移的效率和完整性。

4. 主抗体选择：选择适当的主抗体对目标蛋白进行检测，主抗体的产地、克隆型和浓度都会影响实验结果。

需要进行充分的文献调研和优化，以保证实验的准确性和特异性。

5. 二级抗体选择：Western blot实验中一般需要使用带有酶标记物（如HRP）的二级抗体来检测主抗体与蛋白质结合情况。

维真生物-WesternBlot实验方法及注意事项

维真生物-WesternBlot实验方法及注意事项WesternBlot实验方法及注意事项实验原理：WesternBlot印迹方法，又称为免疫印记，是将获得的蛋白质样品通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，对不同分子量的蛋白质进行分离，并通过转移电泳将凝胶上分离到的蛋白质转印至固相支持物（NC膜或PVDF膜）上，用抗靶蛋白的非标记抗体（一抗）与转印后膜上的靶蛋白进行特异性结合，再与经辣根过氧化物酶标记（偶联）的二抗结合，最后用ECL超敏发光液试剂检测。

如果转印膜上含有靶蛋白，经X光片曝光、显影后，则会在X-光片上出现特异性蛋白条带。

实验材料：分离胶及积层胶溶液、水饱和异丁醇、1×Tris?Cl/SDS,pH8.8 、蛋白质分子量标准混合物、1×SDS电泳缓冲液、电泳装置及夹子、玻璃板、灌胶支架、缓冲液槽等附件、0.75mm封边垫片、0.75mm样品梳子、50μl微量加样器、恒流电源常用试剂：1）30%丙烯酰胺/0.8% N,N’-亚甲丙烯酰胺将30克丙烯酰胺和0.8克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml 水中，加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。

0.45μm 微孔滤膜过滤除菌，查证该溶液pH应不大于7.0，置棕色瓶中保存。

小心：丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。

称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。

可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。

2）4×Tris?Cl/SDS,pH8.8,在300mlH2O中溶解91g Tris碱(1.5mol/L)，用1mol/L调节pH 至8.8,补加H2O至体积500ml。

用0.45μm滤膜过滤溶液，再加入2g SDS[0.4%(w/v)]，于4℃可保存1月。

3）4×Tris?Cl/SDS,pH6.8,在40mlH2O中溶解6.05g Tris碱(0.5mol/L)，用1mol/L调节pH 至6.8,补加H2O至体积100ml。

Western印迹法原理、操作步骤及应用

Western印迹法的原理及应用一、原理免疫印迹法（Western印迹法）是将经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或放射性核素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

典型的印迹实验包括三个步骤：①蛋白质的电泳分离；②将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上，用非特异性、非反应活性分子封闭固体膜上未吸附蛋白质区域；③免疫学检测。

免疫印迹法克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳后直接在凝胶上进行免疫学分析的弊端，极大地提高了其利用率、分辨率和灵敏度，使其成为使用最广泛的免疫化学方法之一。

二、材料Western印迹法所需材料包括SDS-PAGE试剂，硝酸纤维素薄膜，匀浆缓冲液，转膜缓冲液，膜染色液，显色液，酶标二抗及其底物等。

三、操作步骤（一）样品制备培养细胞及组织样品加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5～1分钟。

细菌诱导表达的原核细胞，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞。

然后4℃，13 000g离心15分钟，取上清液作为样品。

（二）SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳是目前对蛋白质进行分离、纯度鉴定及分子量测定的主要方法之一。

十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子去污剂，可与蛋白质结合，使蛋白质变性并带上大量负电荷。

SDS-PAGE是最常用的凝胶电泳技术。

它通常采用不连续电泳系统，即用上层胶（成层胶）和下层胶（分离胶）两种不同浓度的凝胶灌制凝胶板。

SDS-PAGE通过其电荷效应、浓缩效应和分子筛效应，达到蛋白质高分辨率的分离效果。

抗原等蛋白样品经SDS处理后带负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。

此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。

免疫印迹法的实验技术PPT课件

根据实验结果和反馈，不断优化和改进实验条件和方法，提高实验质量。
改进实验方法
积极探索和尝试新的实验方法和技术，提高实验效率案例一：病毒抗原的检测
总结词
高效、准确
详细描述
免疫印迹法在病毒抗原检测中具有高效、准确的优点，能够快速识别病毒抗原，为临床诊断和治疗提供有力支持。
疾病诊断
药物研发
通过检测患者血清或其他体液中的蛋白质表达水平，辅助医生对疾病进行早期诊断、分型和监测病情进展。
在药物筛选和药效评估过程中，利用免疫印迹法检测药物对特定蛋白质表达的影响，从而评估药物的疗效和安全性。
生物标志物研究
蛋白质相互作用研究
通过免疫印迹法检测生物样本中特定蛋白质的表达水平，有助于揭示生物标志物与疾病发生、发展之间的关系。
存。
03
实验操作流程
样品处理与分离
样品选择
选择适当的组织或细胞样品，确保其具有代表性。
蛋白提取
使用适当的缓冲液和蛋白提取试剂，确保蛋白质的完整性和活性。
细胞分离
根据细胞类型和实验需求，采用不同的分离方法，如组织匀浆、离心等。
蛋白定量
采用BCA法、Bradford法等方法对提取的蛋白进行定量，以便后续操作。
转印与封闭
01
02
03
转印膜选择
根据实验需求选择适当的转印膜，如NC膜、PVDF 膜等。
转印条件
设置适当的电流、电压和转印时间，确保蛋白质成功转移至膜上。
封闭操作
采用合适的封闭液对转印膜进行封闭，以减少非特异性结合。
免疫反应与显色
一抗选择
根据实验目的选择特异性的一抗，确保与目标蛋白的结合。
案例二：肿瘤标志物的检测

蛋白质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验方法原理步骤及注意事项

蛋白质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验方法原理步骤及注意事项实验方法原理Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。

对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

实验材料蛋白质样品试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HClβ-巯基乙醇ddH2O甘氨酸Tris甲醇PBSNaClKClNa2HPO4KH2PO4ddH2O考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2DAB试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒实验步骤一、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。

2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0ml；β-巯基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。

3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。

4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO41.44g；KH2PO40.24 g；加ddH2O至1000 ml。

5. 膜染色液：考马斯亮兰0.2 g；甲醇80 ml；乙酸 2 ml；ddH2O118 ml。

蛋白免疫印迹实验注意事项

蛋白免疫印迹实验注意事项
1.标记探针：应选择适当的标记方式，例如荧光标记或酶标记，以确保检测结果的准确性和可靠性。

2.样品制备：应根据实验目的和特点制备样品，取样时遵循标准化程序，例如选择适当的组织，确定样品的种类和数量等。

3.准备蛋白样品：可使用常规离心和浮渣等方法来纯化蛋白质样品。

同时，应使用合适的分离条件，例如SDS-PAGE分离等方法。

4.电泳条件：在进行SDS-PAGE分离时应注意电泳条件、电泳时间和电极的电位等参数。

这些参数应经过适当的优化，以确保蛋白质分离的完整性和稳定性。

5.膜修饰：在进行印迹前，应对PVDF或NC膜进行预处理，以提高其亲水性和蛋白吸附性能，例如使用甲醇或乙醇水溶液进行湿润处理。

6.印迹条件：印迹条件应根据探针和样品的特性进行优化，例如印迹的温度、时间和探针浓度等。

在印迹后，应及时清洗膜以去除多余的标记物。

7.数据分析：印迹结果应准确地获取并进行合理的解释和分析，注意4°C或-20°C保存条件。

8.良好的实验室卫生：应保证实验室的卫生和环境良好，以避免外源性影响实验结果。

同时，应加强实验室安全意识，严格按照实验安全规范进行操作。

Western印迹法

Western 印迹法Western印迹法又称为免疫印迹（immunoblot）。

是用特异性抗体鉴定已被分离并转移到一种膜上的蛋白质混合物中的特殊抗原的方法。

即针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测的方法。

Western Blot 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

经过PAGE电泳分离的蛋白质样品，转移到固相载体上（固相载体以非共价键吸附蛋白质，并能保持其类型和生物学活性的不变）。

二、基本原理当蛋白质经高分辨率的SDS-PAGE电泳后，可被分离成许多不同的蛋白质区带，由于蛋白质的各个组分被固定于凝胶的网状结构中，可以将电泳后的蛋白带经电转移技术，转移到固相的硝酸纤维素膜上，再和特异性的抗体结合，经直接或间接抗原-抗体反应显示特异性的阳性条带。

Western印迹法分三个阶段进行第一阶段为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。

蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度越快。

此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。

第二阶段为电转移。

将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压转移即可完成。

此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。

第三阶段为酶免疫定位。

将印有蛋白条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体（一抗）和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色，阳性反应的条带清晰可辨。

三、操作步骤一）配制SDS-PAG 灌胶:分离胶浓缩胶二）上样蛋白质样品的制备直接用电泳加样缓冲液裂解细胞制备细胞蛋白质提取液三）SDS-PAGESDS-蛋白质复合物的电泳迁移率只与其分子量有关。

在一定条件下，迁移率与分子量呈对数线性关系。

丙烯酰胺凝胶对蛋白质的分辨范围丙烯酰胺（%[w/v]）分离范围（kDa）15 15~4512.5 15~6010 18~757.5 30~1205 60~212（四）蛋白质的电转移打开蛋白质转移槽的胶板，依次放入：海绵、两张滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜、再两张滤纸、海绵（以上所有的材料都需缓冲液浸湿，凝胶也必须保持湿润），合上转移槽的胶板，放入转移槽中，凝胶在负极一侧，倒入转移缓冲液，电泳。

免疫印迹过程中转膜的注意事项

免疫印迹过程中转膜的注意事项一、前言免疫印迹技术是分子生物学中常用的实验方法之一，其核心步骤是将蛋白质样品经过电泳分离后，通过膜转移技术将蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶（PVDF）或硝酸纤维素（NC）膜上，然后使用特异性抗体与目标蛋白结合，最终通过化学发光或染色等方式检测目标蛋白的存在。

而在转移过程中，转膜步骤的操作技巧和注意事项对于实验结果至关重要。

下面将详细介绍免疫印迹过程中转膜的注意事项。

二、硝酸纤维素和聚丙烯酰胺凝胶的选择在选择转移膜之前，需要考虑样品的性质和实验需要。

一般来说，硝酸纤维素适用于小分子量（<20 kDa）的目标蛋白和高通量实验；而PVDF适用于大分子量（>20 kDa）的目标蛋白和需要高灵敏度检测的实验。

因此，在选择转移膜时需要根据实验需要和样品性质进行选择。

三、转膜前的准备工作1. 准备好电泳仪、转膜装置、转移缓冲液等设备和试剂，确保其完好无损。

2. 按照转移缓冲液说明书的要求配制好缓冲液，并在合适的时间内使用，避免因缓冲液老化导致转膜效果不佳。

3. 将硝酸纤维素或PVDF膜放入转膜装置中，注意不要在膜上留下气泡或皱纹。

4. 将转移装置放入电泳槽中，加入足够的缓冲液，确保电极片完全浸没在缓冲液中。

四、样品处理和加载1. 样品应该经过充分的处理和净化，避免存在杂质或其他影响实验结果的物质。

2. 样品应该在合适的时间内加载至凝胶中，并且应该均匀地分布在凝胶上。

3. 在加载样品之前，可以将凝胶表面用棉签轻轻擦拭一遍，以去除表面可能存在的杂质或污染物。

五、转膜条件的控制1. 转膜时间和电流密度应该根据样品的性质和膜的类型进行调整，通常转膜时间为1-2小时，电流密度为0.8-1.0 mA/cm2。

2. 在转膜过程中，需要注意转移缓冲液的温度和pH值，保持其稳定性。

3. 在转膜过程中，需要定期检查电极片和缓冲液的状态，并及时更换或调整。

六、转膜后的处理1. 转移完毕后，将膜从装置中取出，并用去离子水或甲醇洗涤一遍。

免疫印迹过程中转膜的注意事项

免疫印迹过程中转膜的注意事项1. 选择合适的转膜膜材和尺寸转膜在免疫印迹实验中起到关键作用，因此选择合适的转膜膜材和尺寸是十分重要的。

1.1 转膜膜材的选择常用的转膜膜材有聚丙烯酰胺膜（PVDF）和硝酸纤维素膜（NC）。

PVDF膜对于大分子蛋白质有较好的吸附能力，而NC膜则更适用于低分子量蛋白质和多肽。

根据实验需求选择适合的转膜膜材。

1.2 转膜尺寸的选择转膜尺寸应根据印迹膜的尺寸和实验需求来确定。

一般来说，转膜的尺寸应大于印迹膜的尺寸，以充分覆盖印迹膜上的蛋白质带。

2. 转膜前的准备工作在进行免疫印迹过程中的转膜操作前，需要进行一系列的准备工作，以确保实验的顺利进行。

2.1 转膜池和转膜缓冲液的准备转膜过程中需要使用转膜池和转膜缓冲液。

转膜池应选用无污染的容器，保持其干净并具有足够的容量。

转膜缓冲液的配制需根据具体实验方案来确定。

2.2 转膜膜的准备将转膜膜放入转膜池中的转膜缓冲液中浸泡，去除气泡并确保转膜膜完全湿润。

在转膜前，应先进行预转运处理，如使用甲醇或亚硫酸盐等溶液进行处理。

预转运处理的具体方法需根据所使用的转膜膜材来确定。

2.3 转膜装置的准备转膜装置的准备包括组装转膜夹具和连接电源。

在组装转膜夹具时，注意调整夹具的压力和紧固度，以确保转膜过程中的效果。

3. 转膜操作步骤进行免疫印迹实验时，正确的转膜操作步骤是确保实验结果准确的关键。

3.1 准备转膜池在转膜操作前，先将转膜池放入冰箱或冷藏室中冷却。

这样可以防止转膜过程中由于温度过高引起的蛋白质的不均匀转移。

3.2 安装转膜膜取出预处理好的转膜膜，将其平整地放置在转膜夹具中。

确保转膜膜的整个面积都覆盖在夹具的活性区域内。

3.3 转膜将预处理好的凝胶放置在转膜膜的上方，并将转膜夹具盖在凝胶上。

调整夹具的压力，使得转膜膜与凝胶的接触均匀。

3.4 电转膜连接转膜装置的电源，根据实验要求设定适当的电流和时间。

在转膜过程中，注意电流稳定性和温度控制。

免疫印迹实验注意事项

免疫印迹实验注意事项
免疫印迹实验是一种常用的蛋白质分析技术，用于检测特定抗原在细胞或组织中的存在和表达水平。

在进行免疫印迹实验前，有一些注意事项需要特别关注，以确保实验的准确性和可靠性。

首先，实验者需要严格遵守实验室的安全操作规范，戴好实验手套、实验衣和护目镜等防护装备，以防止对自身和他人的伤害。

在样品处理过程中，要确保所有试剂和材料的质量和保存状态良好。

对于抗体和蛋白质标记物，要特别注意其稳定性、纯度和适用性。

此外，对于细胞和组织样品的采集和保存，要遵循标准操作程序，避免可能的污染和降解。

在进行电泳分离前，需要正确配置和准备电泳缓冲液，并确保电泳槽和电极的清洁。

对于蛋白样品的加载量，要根据实验要求进行优化，并尽量避免过载或欠载。

在转膜过程中，应选择适合的膜材料和方法，并注意转膜时间、电压和温度的控制。

转膜完成后，应检查转膜效果，确保蛋白质在膜上的均匀分布和完整转移。

在免疫印迹的蛋白质检测步骤中，要注意抗体的选择和配对，确保抗
原-抗体的特异性和亲和性。

对于抗体交叉反应的可能性，可以进行
阴性对照实验和多步骤的检测验证。

此外，对于抗体的浓度和孵育时间等条件，也需要进行优化和标准化。

在成像和数据分析阶段，要注意选择合适的成像设备和图像分析软件，确保图像的清晰度和准确性。

对于蛋白质信号的定量分析，要进行内部参考蛋白的标准化和正常化，以减少实验误差和结果的偏差。

总之，免疫印迹实验的成功与否，往往取决于实验者的经验和技术能力，以及实验操作的细致和规范程度。

遵循上述注意事项，将有助于提高实验的可靠性和重现性，从而获得准确的实验结果。

WB免疫印迹实验常见问题全汇总

【干货收藏贴】WB常见问题精品全集锦做了很久的WB（western blot），走了很多弯路，但是WB想要做好并不难，总结WB实验中可能会遇到的问题，分析可能的原因及对应的解决方案，这就是实验成功的基石。

以下，我们先解决很多技术菌的疑惑，然后再着手汇总实验中常见问题和可能原因分析以及给出建议解决方案。

WB常见问题分析1.为什么我的细胞提取液中没有检测到目的蛋白？原因有很多：a) 细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞；b) 细胞中的蛋白质被降解掉了，可加入蛋白酶抑制剂，抑制蛋白酶活性；c) 抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，是否有问题；d) 酶降解可能是没有保持低温操作，样品保存不当，样品放置时间过长。

2.我做的蛋白质分子量很小（10KDa），请问怎么做WB？a)可以选择PSQ 膜，同时缩短转移时间。

也可以将两张膜叠在一起，再转移。

其他按步骤即可；b)也可选择孔径0.22um的PVDF膜或者NC膜，转膜时间缩短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE体系。

3.我的目的带很弱，如何加强？a)可以加大抗原上样量，这是最主要的；b)也可以将一抗稀释比例降低；c)还可以延长曝光时间。

4.DAB好还是ECL好？DAB 有毒，但是比较灵敏，是HRP 最敏感的底物；ECL结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg 级抗原。

5.胶片是一片空白，是怎么回事？如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。

a) 二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光；b) ECM底物中H2O2，不稳定，失活；c) ECL底物没覆盖到相应位置；d) 一抗选择不当二抗失活；e) 二抗失活。

6.磷酸化抗体的检测样本制备时是否一定要加NaF等？NaF是一种广谱磷酸化酶的抑制剂，一般最好加。

但是不加也可以，大部分时候是不用加的。

7.细胞水平要做WB，多少细胞提的蛋白够做WB？一般5×106就足够。

western免疫印迹的注意事项

western免疫印迹实验流程和蛋白条带的注意事项一、条带中所遇到的情况1. 完全没有条带完全没有条带的原因主要有以下4点：（1）抗体加错（最常见一抗加错抗体，或二抗种属加错）。

（2）转膜出现了问题（常见膜放反）。

（3）发光液失效或不够灵敏。

（4）蛋白上样量过少，一抗浓度太低2. 目的条带有但高背景高背景可能是WB中最常见出现的问题，目的条带单一清晰，但是其他地方又弥漫性较为均一的背景，主要原因：（1）洗膜时间和次数不够（常用10min*3）。

（2）封闭不够好。

（3）一抗浓度过高，可通过调整一抗浓度来降低背景。

3.出现非均一性背景原因：膜可能曾经干过，在封闭的时候，洗一抗，洗二抗，以及发光的时候都时刻需要注意蛋白面不要风干，风干之后结果很可能就是这个样子。

注意与高背景区别。

4.背景出现黑点由于封闭时牛奶不纯，没有完全溶解致使颗粒残留，同时封闭后清洗不完全，也会导致背景出现黑色斑点。

5.条带上有白色小点由于电转中膜和胶之间存在气泡，转膜时一定要将气泡都去除。

6.非特异性条带主要由于一抗非特异性与蛋白结合，建议更换抗体。

7.条带拖尾主要原因：（1）蛋白量太大。

（2）一抗浓度过大，孵育时间太长。

8.条带呈哑铃状（1）胶在配置过程中未冷却完全，胶不够均一。

（2）样品中含有太多杂质，没有离心下来，杂质沉积在孔的中间。

9.电泳中出现问题（1）整个条带呈“ ︶” 状：凝胶冷却不均一，电泳时电压过大发热，应该降低电压或者冰浴。

（2）整个条带呈“ ︵”：凝胶左右两头没有凝固好（3）溴酚蓝拖尾：样品溶解不好。

（4）纵向的纹理：上样样品中存在不溶性颗粒（5）溴酚蓝很粗：浓缩胶浓缩效果不好，可能是浓缩胶太短，或者是浓缩胶配错。

（6）在分离胶中跑不动：Tris-Cl PH值不对，或者忘记加SDS。

二、内参的选择1. Actin，Tubulin，GAPDH都为最常用的内参抗体，Actin，Tubulin的缺点是有时候会出现复带，GAPDH与前两者相比比较稳定，建议选择。

免疫印迹法的原理

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免疫印迹法的原理（大纲）一、免疫印迹法概述1.1免疫印迹法的定义1.2免疫印迹法的应用领域二、免疫印迹法的原理2.1蛋白质的电泳分离2.1.1SDS-PAGE原理2.1.2蛋白质样品的准备2.1.3电泳设备与操作2.2蛋白质的电转移2.2.1电转移原理2.2.2电转移设备与操作2.3抗原-抗体反应2.3.1抗体的选择与使用2.3.2抗原抗体复合物的形成2.4检测方法2.4.1化学发光法2.4.2酶联免疫吸附法（ELISA）2.4.3其他检测方法三、免疫印迹法的操作步骤3.1蛋白样品的准备3.2电泳分离3.3电转移3.4封闭与抗体孵育3.5洗涤与检测3.6结果分析四、免疫印迹法的注意事项4.1实验材料的选择与保存4.2实验操作技巧4.3常见问题与解决方案五、免疫印迹法的应用实例5.1蛋白质表达分析5.2蛋白质磷酸化研究5.3蛋白质相互作用研究5.4疾病诊断与生物标志物发现六、免疫印迹法的发展趋势与展望6.1高通量免疫印迹技术6.2蛋白质组学研究中的应用6.3新型免疫印迹技术的开发与应用6.4免疫印迹法的自动化与智能化发展一、免疫印迹法概述免疫印迹法（Western Blotting）是一种分子生物学技术，用于检测蛋白质在细胞或组织中的存在和表达水平。