高效液相色谱串联质谱法检测美金刚血浆浓度

高效液相色谱串联质谱法检测美金刚血

浆浓度

目的：建立高效液相色谱串联质谱法测定人体血浆中美金刚的浓度。

为内标，方法：采用Triple Quad-4500的液质联用技术系统，以美金刚-d

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血浆经乙腈蛋白沉淀后，采取Agilent EC-C18 2.7μm 50x4.6mm色谱柱分离，

以多反应检测模式（MRM）进行检测。

结果：美金刚的线性范围为0.6ng/mL~225ng/mL，提取回收率和内标平均提

取回收率分别为96.31%～98.08%和106.70%，批内和批间准确度精密度均＜15%。

结论：该方法简便、快速、灵敏，重现性好，适应于美金刚人体内血药浓度

的测定及其药代动力学和生物等效性研究。

关键词：美金刚、高效液相色谱串联质谱法、含量测定

盐酸美金刚是FDA批准的第1个用于治疗中、重度阿尔茨海默病

(Alzheimer's disease,AD)的药物，主要通过调节脑内谷氨酸水平发挥作用。临

床研究表明,盐酸美金刚是一种安全、有效，且较有市场前景的药物。

本文建立HPLC-MS/MS法测定人血浆中美金刚的浓度，采用乙腈蛋白沉淀法，简单，快速，稳定，可同时满足临床药代动力学及生物等效性研究中大批量样品

分析的要求。

1.

仪器与对照品

美国应用生物系统公司Triple Quad-4500三重四极杆质谱仪，配ESI（电喷

雾离子源），日本岛津UPLC-30A超高效液相系统。

美金刚来源：USP，批号：R044E0；美金刚-d

来源：TLC，批号：1221-081A6。

3

1.

方法

2.1液相色谱-质谱条件

液相条件：色谱柱为Agilent EC-C18 2.7μm 50x4.6mm，流动相乙腈-0.4%甲酸水溶液（PH=3.20），流速0.6mL/min，进样体积5μL。

质谱条件：ESI（电喷雾离子源），正离子检测，其中离子化电压4500V，干燥器温度500℃，气帘气压力45psi，雾化气压力50psi，涡轮气压力50psi，多反应检测（MRM）方式定量，美金刚180.1→163.1，美金刚-d

183.5→166.2。

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2.2溶液的配制

2.2.1对照品溶液称取美金刚对照品，用甲醇溶解配制成1mg/mL储备液。在用甲醇将美金刚储备液依次稀释成30、60、200、400、1000、2500和

3000ng/mL的工作溶液，及30、90、300、2250ng/mL的质控溶液。

2.2.2内标溶液用适量的甲醇溶解内标对照品，配制成1mg/mL的内标储备液，并将储备液稀释至400ng/mL作为内标工作液。

2.3样品前处理移取100μL血浆样品，加入10μL内标工作液。再加入390μL乙腈，涡旋3分钟后，在4000rpm、4°C条件下离心5分钟，移取上清液100μL。再加入200μL的超纯水，涡旋3分钟，在4000rpm、4°C条件下离心5分钟，交由LC-MS/MS分析。

2.4标准曲线与线性范围移取490μL的空白血浆，向其中加入10μL工作液，配制得到浓度为0.6、1.2、4、8、20、50、60ng/mL的血浆样品，按样品前处理的方法，以美金刚与内标峰面积比值为纵坐标（y），美金刚浓度为横坐标（x），用加权最小二乘法，权重因子为1/X2进行线性回归，在浓度范围内美金刚线性关系良好，满足线性要求。

2.5准确度和精密度移取490μL的空白血浆，向其中加入10μL工作液，配制得到浓度为1.8、6、45ng/mL的血浆质控样品，按血浆样品预处理的方法，

对各浓度质控样品进行了连续3天的6份样品分析。美金刚3个浓度质控样品批

内准确度偏差在-6.67%~13.33%之间，批内精密度在1.77%~7.09%之间，批间准确

度偏差在-1.63%~1.70%之间，批间精密度在2.70%~5.25%之间。均满足中国药典

四部“9012，生物样品定量分析方法验证指导原则”的相应接受标准。

2.6选择性考察考察6个不同来源的空白人血浆，均未检测到待测物及内标峰、内标空白样品中也未检测到待测物峰、不含内标的待测物定量上限样品中未

检测到内标峰。结果表明不同来源的空白人血浆对美金刚及内标的测定不存在干扰，且美金刚以及内标之间也不存在相互干扰。

2.7基质效应选取6个不同来源的空白人血浆，考察生物基质对待测物和内

标响应的影响，实验结果表明人血浆中美金刚和内标化合物的测定不受生物基质

的影响。

2.8提取回收率本方法考察了3个浓度质控样品的提取回收率及内标的提取

回收率。3个浓度质控样品的平均提取回收率分别为96.31%、99.86%、98.08%，

内标的平均提取回收率为106.70%，表明本方法美金刚具有足够且均一的提取回

收率。

2.9稳定性考察

2.9.1溶液稳定性

溶液室温稳定性考察了美金刚的储备液（1.00mg/mL）在室温下放置21小时、工作液（30ng/mL）在室温下放置16小时后的稳定性，结果仍保持稳定。

内标工作溶液稳定性考察了内标工作溶液在室温下放置21小时后的稳定性，结果仍保持稳定。

溶液长期稳定性考察了美金刚储备液（1.00mg/mL）-20℃条件下放置约94

天和工作液（30.0ng/mL）-20℃条件下放置约93天的稳定性。结果仍保持稳定。

2.9.2基质中美金刚的稳定性

美金刚在人血浆中的室温稳定性考察了分析物高、低浓度质控样品在室温条件下放置约19小时的稳定性，结果仍保持稳定。

美金刚在人血浆中的长期稳定性考察了低、高浓度质控样品于-20°C条件下放置93天、-80°C条件下放置93天稳定性，结果仍保持稳定。

美金刚在人血浆中的冻融稳定性考察是将低、高浓度质控样品置于-20°C和-80°C条件下冷冻12小时后，于室温条件下放置至少2小时，待其完全融化。反复冻融5次，在进行LC-MS/MS分析，结果仍保持稳定。

全血稳定性考察了美金刚在人全血高、低浓度质控样品在冰浴下放置2小时后的稳定性，结果仍保持稳定。

制备后样品的稳定性考察了美金刚在制备后室温条件下放置约65小时后重新分析其结果的重现性，结果仍能较好的重现其结果。

2.10溶血效应溶血效应考察了美金刚人血浆溶血现象对高、低浓度质控样品中美金刚真实浓度的影响。结果均满足相应的接受标准，表明人血浆溶血现象对美金刚血浆样品真实浓度无影响。

2.11高脂效应高脂效应考察了美金刚人血浆高脂现象对高、低浓度质控样品中美金刚真实浓度的影响。结果均满足相应的接受标准，表明人血浆高脂现象对美金刚血浆样品真实浓度无影响。

2.12进样残留评价进样残留考察评价分析批中美金刚和内标从一个较高浓度的样品到下一个样品的残留。在分析批中每个线性最高点样品后紧接着进样分析一个空白样品。本方法中高点后空白未见显著进样残留。

2.13选择性干扰本方法考察了6个不同来源空白人血浆。结果表明不同来源的基质对美金刚和内标的测定不存在干扰，内标对化合物不存在干扰，化合物对内标也不存在相互干扰。

1.

小结