荧光定量pcr引物设计原则

1.引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。

最好位于编码区5’端的300-400bp区域
内，可以用DNAman,Alignment 软件看看结果。

2. 产物不能形成二级结构（自由能小于58.61KJ/mol）。

3.引物长度一般在17-25碱基之间,上下游引物不能相差太大。

4.G+C含量在40%~60%之间，45-55％最佳。

5.碱基要随机分布，尽量均匀。

6.引物自身不能有连续4个碱基的互补。

7.引物之间不能有连续4个碱基的互补。

8.引物5′端可以修饰。

9.3′端不可修饰，而且要避开AT,GC rich的区域，避开T/C,A/G连续结构（2-3个）。

10. 引物3′端要避开密码子的第3位。

11.引物整体设计自由能分布5‘端大于3’端，且3‘端自由能最好小于9KJ/mol。

可用oligo 6 软件进行比对看结果的情况。

12.做荧光定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp.
13.引物设计避免DNA污染，最好跨外显子接头区。

14.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70％或者有8个互补碱基同源。

15.查看有无假基因的存在。

假基因就是无功能的DNA序列，与需要扩增的目的片段长
度相似。

16.TM值在58-62度之间。

17.引物设计的软件Primer 5.0 有专门针对荧光的。

设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。

引物分析软件将试图通过使用每一引物设计变化的预定值在这两个目标间取得平衡。

设计引用有一些需要注意的基本原理：
①引物长度
一般引物长度为18~30碱基。

总的说来，决定引物退火温度（Tm值）最重要的因素就是引物的长度。

有以下公式可以用于粗略计算引物的退火温度。

在引物长度小于20bp时：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃
在引物长度大于20bp时：62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃
另外有许多软件也可以对退火温度进行计算，其计算原理会各有不同，因此有时计算出的数值可能会有少量差距。

为了优化PCR反应，使用确保退火温度不低于54℃的最短的引物可获得最好的效率和特异性。

总的说来，每增加一个核苷酸引物特异性提高4倍，这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。

引物长度的上限并不很重要，主要与反应效率有关。

由于熵的原因，引物越长，它退火结合到靶DNA上
形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板的速率越小。

②GC含量
一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%，一对引物的GC含量和Tm值应该协调。

若是引物存在严重
的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴。

③退火温度
退火温度需要比解链温度低5℃，如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，是DNA双链结合。

一对引物的退火温度相差4℃～6℃不会影响PCR的产率，但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的，可以在55℃～75℃间变化。

④避免扩增模板的二级结构区域
选择扩增片段时最好避开模板的二级结构区域。

用有关计算机软件可以预测估计目的片段的稳定二级结构，有助于选择模板。

实验表明，待扩区域自由能（△G）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。

若不能避
开这一区域时，用7-deaza-2’-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。

⑤与靶DNA的错配
当被扩增的靶DNA序列较大的时候，一个引物就有可能与靶DNA的多个地方结合，造成结果中有多个条带出现。

这个时候有必要先使用BLAST软件进行检测，网址：/BLAST/。

选择Align two sequences (bl2seq)，如下图。

BLAST的使用方法也十分简单，如下图所示。

将引物序列粘贴到1区，将靶DNA序列粘贴到2区，这两者可以互换的，并且BLAST会计算互补、反义链等多种可能，所以不需要用户注意两条链是否都是有义链。

如果知道序列在数据库中的GI号也可以直接
输入GI号，这样就不用粘贴一大段的序列了。

最后在3处点击Align就可以查看引物在靶DNA中是否有多个同源位点了。

可是使用BLAST还是有其不方便的地方。

因为它一次只能比较两条序列，那么一对引物就需要分开进行比对。

如果存在错配，还需要自己计算由于错配形成的片段长度有多大。

在下一篇中将介绍一个软件，可以直接将靶DNA和引物输入对产物片段进行预测。

⑥引物末端
引物3’端是延伸开始的地方，因此要防止错配就从这里开始。

3’端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。

3′端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3′端不能发生错配。

如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。

⑦引物的二级结构
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构，这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。

若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。

两引物之间不应该存在互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。

一般情况下，一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。

⑧为了下一步操作而产生的不完全匹配
5’端对扩增特异性影响不大，因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。

引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。

额外的碱基或多或少会影响扩增的效率，还加大引物二聚体形成的几率，但是为了下一步的操作就要作出适当的“牺牲”。

很多时候PCR只是初步克隆，之后我们还需要将目的片段亚克隆到各种载体上，那么就需要在PCR这个步骤为下一步的操作设计额外的碱基。

以下总结一些为了亚克隆所要设计的序列。

a 添加限制性内切酶酶切位点
添加酶切位点是将PCR产物进行亚克隆使用得最多的手段。

一般酶切位点是六个碱基，另外在酶切位点的5’端还需要加2～3个保护碱基。

但是不同的酶需要的保护碱基数目是不相同的，例如：SalⅠ不需要保护碱基，EcoRⅤ需要1个，NotⅠ需要2个，Hind Ⅲ3个。

其中，在原核表达设计引物时还有一些小技巧，大家可以参考：《原核表达之实验前的分析》。

里面一些规则是所有表达都通用的。

有一种做法是在进行PCR反应的同时进行酶切，这样就需要注意一些内切酶在PCR反应中的酶切反应率，见附录。

不过这种方法虽然方便但并不推荐。

有时候，就是把PCR产物回收后酶切再与载体连接效果都不尽理想，同步进行会使出现问题的原因变得更加复杂。

一旦出现问题，分析起来更麻烦。

b LIC添加尾巴
LIC的全称是Ligation-Independent cloning，它是Navogen公司专门为其部分的pET载体而发明的一种克隆方法。

用LIC 法制备的pET 载体有不互补的12–15 碱基单链粘端，与目的插入片段上相应粘端互补。

扩增目的插入片段的引物5'序列要与LIC载体互补。

T4 DNA 聚合酶的3'→5'外切活性经短时间即可在插入片段上形成单链粘端。

由于只能由制备好的插入片段和载体互相退火形成产物，这种方法非常快速高效，而且为定向克隆。

c 定向TA克隆添加尾巴
在T载体刚出的时候大家都拍手称赞，真是方便，哪个小子脑子这么聪明想出来的。

但是后来人们发现TA克隆无法将片段定向克隆到载体中，所以后来Invitrogen推出了可以定向克隆的载体，它的一端含有四个突出的碱基GTGG。

因此在PCR引物设计时也要相应的加上与之互补的序列，这样片段就可以“有方向”了。

d In-Fusion克隆方法
这项技术是Clontech还属于BD的时候推出的。

此技术就其步骤来说是及其方便的，不需连接酶，不需长时间的反应。

只要在设计引物的时候引入一段线性化载体两端的序列，然后将PCR产物和线性化的载体加入到含有BSA的In-Fusion酶溶液中，在室温下放置半个小时就可以进行转化了。

这种方法特别适合大批量的转化。

如果要加入额外的碱基总是或多或少会影响到整个PCR反应，比如在加入NotⅠ的酶切位点后整个引物的退火温度就会直线上升（它识别的是8个碱基，且全为GC），这样使另外一个引物的设计变得十分困难，因为一对引物间退火温度相差不宜太远。

因此上面提到许多设计原则在实际应用中往往难以做
到都符合。

在碰到这些情况的时候，我们只能秉着“实践是检验真理的唯一标准”这一原则，要试一试才能知道能否行得通了
《简爱》是一本具有多年历史的文学着作。

至今已152年的历史了。

它的成功在于它详细的内容，精彩的片段。

在译序中，它还详细地介绍了《简爱》的作者一些背景故事。

从中我了解到了作者夏洛蒂．勃郎特的许多事。

她出生在一个年经济困顿、多灾多难的家庭；居住在一个远离尘器的穷乡僻壤；生活在革命势头正健，国家由农民向工业国过渡，新兴资产阶级日益壮大的时代，这些都给她的小说创作上打上了可见的烙印。

可惜，上帝似乎毫不吝啬的塑造了这个天才们。

有似乎急不可耐伸出了毁灭之手。

这些才华横溢的儿女，都无一例外的先于父亲再人生的黄金时间离开了人间。

惜乎，勃郎特姐妹！
《简爱》这本小说，主要通过简。

爱与罗切斯特之间一波三折的爱情故事，塑造了一个出生低微、生活道路曲折，却始终坚持维护独立人格、追求个性自由、主张人生平等、不向人生低头的坚强女性。

简。

爱生存在一个父母双亡，寄人篱下的环境。

从小就承受着与同龄人不一样的待遇：姨妈的嫌弃，表姐的蔑视，表哥的侮辱和毒打。

然而，她并没有绝望，她并没有自我摧毁，并没有在侮辱中沉沦。

所带来的种种不幸的一切，相反，换回的却是简。

爱的无限信心，却是简。

爱的坚强不屈的精神，一种可战胜的内在人格力量。

不幸，在学习生活中，简。

爱仍然是承受着肉体上的受罚和心灵上的催残。

学校的施主罗可赫斯特不但当着全校师生的面诋毁她，而且把她置于耻辱台上示众。

使她在全校师生面前丢尽了脸。

但简。

爱仍坚强不屈，化悲愤为力量，不但在学习上飞速进步，而且也取得了师生们的理解。

不久，简。

爱又陷入了爱情的旋涡。

个性及强的她同样保持着个人高贵的尊严，在情敌面前显得大家闺秀，毫不逊色，对于英格拉姆小姐的咄咄逼人，她从容面对。

同样，在罗切斯特的面前，她从不因为自己是一个地位低贱的家庭教师，而感到自卑，她认为他们是平等的。

不应该因为她是仆人，而不能受到别人的尊重。

也正因为她的正直，高尚，纯洁，心灵没有受到世俗社会的污染。

使得罗切斯特感到自惭性秽，同时对她肃然起敬，并深深地爱上了她。

他的真心，让她感动，她接受了他。

后来，简。

爱发现罗切斯特已有了妻子，她的自尊自重再次出现，毫不犹豫地离开了他，她对爱情的专一，让我敬佩。

最后，简。

爱得知，罗切斯特为了拯救在活中的妻子不幸双目失明。

躯体严重残疾，完全丧失了生活能力，而同时又妻亡财毁。

简。

爱全身心的爱再次投入了他的怀抱。

从这本书中，可以看出它塑造了一个体现新兴阶级的某些要求的女性形象，刻画了工业革命时期的时代精神。

简爱读书心得1000字二：
前几天，我刚读完了一本书，书的名字叫做《简·爱》。

这本书的作者叫夏洛蒂·勃朗特，她有两个妹妹，她们都是女强人。

夏洛蒂·勃朗特我对她有些了解，因为我学过一篇关于她的课文。

所以，她的代表作《简·爱》我也就自然而然的知道了。

我曾经听说过《简·爱》的小部分故事，只知道简·爱和一个比她大四岁的约翰打
起仗来，使自己浑身上下伤痕累累，痛苦不堪，还被里德舅妈关在红屋子里，对此，我一直以为简·爱是一个自不量力的人。

然而当我翻开这本书的时候，我才知道，原来简·爱是那么不平凡的一个人，她是一个坚强、善良、勇敢、具有吸引力的小女孩。

刚开始看简·爱时，才发现，原来简·爱是一个弱小的女孩，她常常受到别人的欺负。

但是，她被自己的舅妈的儿子欺负的时候，自己的舅妈却总是睁一只眼闭一只眼，但经过自己的反抗，小简·爱终于可以离开自己的舅妈，离开别人的欺负，来到了劳渥德。

令小简·爱意想不到的是，自己的舅妈居然告诉劳渥德的牧师，说她是一个小骗子，是一个坏孩子。

简·爱虽然小，但她知道尊严，她虽然知道自己蒙受了不白之冤，但是她知道自己的力量小，根本就不能抵抗，但是我知道，她心中有一团怒火正燃烧起来，跟加强了她要永远离开里德舅妈的意念。

在劳渥德的时间里，或许简·爱她觉得很苦，但值得佩服的是，简·爱失去了自己最好的朋友——海伦以后，我发现她变的更坚强了，也让我对她有些刮目相看。

在劳渥德所学到的东西，可以让简·爱当上一名家庭教师，而她工作的地方，也就是在桑菲尔德府。

接下来的时间，简·爱在
桑菲尔德府不仅遇到了天真活泼的小阿黛勒，也使她找到了自己的爱情，虽然在寻求爱情的这段时间中有酸，有甜，有苦，有辣，但她终于熬过来了，并和她的爱人幸福地生活下去。

书的末尾就是这样，这是人人都想得到的结果，也是夏洛蒂·勃朗特的结果。

书中的简·爱虽然不美，但是她淳朴、善良、坚强，最终赢得自己的爱情，这不就是她真正的美吗。

其实，我们看到的简·爱就是夏洛蒂·勃朗特的化身，她告诉了我们要学会坚强，这不正是我们通往成功的道路的需要吗？
简爱读书心得1000字三：
《简·爱》一反传统小说中以温柔美丽的女子做主角、以浪漫动人的爱情传奇为故事的旧格式，写出了一个出身低微、相貌平平的女子与不公平的命运抗争的故事。

主人公简·爱是不幸的，她自幼失去父母，唯一爱她并领养她的舅舅又过早地弃她而逝。

她初涉人世，便过着寄人篱下、任人驱使的悲惨生活，饱尝了人情冷暖、世态炎凉的痛苦。

为了逃避严酷的现实，她把自己的感情寄托在她酷爱的书和大自然上。

书丰富了她的感情世界，陶冶了她的性情，苦难又磨炼了她的意志，使她养成了坚毅倔强、外柔内刚的性格。

小说中，简·爱与桑菲尔德府的男主人罗切斯特的爱情波折，使简·爱的个性得到了充分的体现。

当简·爱发现自己爱上了罗切斯特时，她很清楚地意识到，横在他们之间的鸿沟。

罗切斯特出身名门，十分富有，是英国上层社会的绅士，她出身卑微，不名一文，只是一个地位与佣人差不多的家庭教师，但是，她没有因此而气馁，而妄自菲薄，她勇敢地向自己、向罗切斯特承认了对他的感情。

在结婚仪式上，她才知道罗切斯特已经结过婚，原配妻子尚在人间。

为了维护自己的尊严和婚姻的庄严、合法、纯洁，她不顾罗切斯特的再三恳求，强忍内心的巨大伤痛，毅然决然地离开了罗切斯特，遁入无依无靠的茫茫人世。

在金钱面前，她也有不俗的表现。

在获得叔叔的遗产，一夜之间由赤贫变为富有的时候，她立即就把大部分的遗产转赠给贫困的表哥、表姐。

在她的心目中，亲情比金钱更为重要。

简·爱这位离经叛道的女性，虽然并不美丽，但富有挑战和抗争的个性，使她充满了魅力。

她聪明好学，自尊自爱，尽管社会地位卑微，她决不自甘堕落。

她认为，在上帝面前，人人平等。

她为争取平等地位，为维护自己独立的人格，而抗争、奋斗。

从很小的时候起，她便敢于向欺压她的人反抗，哪怕因此而招致严惩，也不畏惧。

她那不屈不挠，敢于同命运抗争的精神，使那些欺侮她的人胆战心惊。

在爱情方面，她从不奴颜婢膝，也不一味地迎合讨好，她鄙视那些浑身铜臭、以门第出身论人、一味追求虚荣的上流社会的庸俗之辈。

她的头脑始终是清醒的，她从来没有沦为爱情和物质的奴隶，也没有陷入感情的旋涡，而不能自拔。

简·爱为维护公道、维护个人尊严，所作的不屈不挠的斗争，不仅赢得了罗切斯特的尊敬，也使得简·爱这一形象具备了经久不衰的价值。

《简·爱》为千千万万受欺压的下层平民喊出了心声，为千百年来在男尊女卑社会里饱受欺凌的姐妹们喊出了心声，这是它至今仍然是各国的读者最喜爱阅读的小说之一的主要原因。

简爱读书心得1000字四：
曾经有一份挚爱，漂洋过海来到我面前，那便是《简爱》。

它通过简.爱与罗切斯
特之间一波三折的爱情故事，塑造了一个出生低微、生活道路曲折，却始终坚持维护独立人格、追求个性自由、主张人生平等、不向人生低头的坚强女性。

她所象征的女性理想和追求已超越了时空，成了人们心中的永恒。

《简爱》是一部带有自转色彩的长篇小说，它阐释了这样一个主题：人的价值＝尊严＋爱。

在这本书里渗透着最多的就是女性的独立意识。

让我们试想一下，如果简爱的独
立，早已被扼杀在寄人篱下的童年生活里；如果她没有那份独立，她早已和有妻女的罗切斯特生活在一起，开始了有金钱、有地位的新生活。

如果她没有那份纯洁，我们现在手中的《简爱》也不再是令人感动的流泪的经典。

为什么《简爱》让我们感动？——就是她独立的性格，令人心动的人格魅力
本书的作者夏洛蒂.勃朗特和《呼啸山庄》的作者艾米莉是姐妹，但是虽然她们
生活在同一生活环境，和家庭环境中，性格却大不相同。

夏洛蒂的性格比较温柔，很清纯，更加喜欢追求一些美好的东西。

尽管她家境贫穷，从小得不到父母太多的关爱，再加上她容貌不美，身材也很矮小。

但也许就是这样一种灵魂深处的很深的自卑，反映在她的性格上就是一种非常敏感的自尊，以自尊作为她内心深处的自卑的补偿。

她所描写的简.爱也是一个容貌不美，矮小的女人，但是她有着极强的自尊心。

她坚定不移的去追求美好的生活。

简.爱生存在一个父母双亡，寄人篱下的环境，从小就承受着与同龄人不一样的待遇，姨妈的嫌弃，表姐的蔑视，表哥的侮辱和毒打......这是对一个孩子尊严的无情践踏,但也许正是因为这一切,换回了简.爱无限的信心和坚强不屈的精神,一种可战胜的内在人格力量.
她从不因为自己的一个地位低贱的家庭教师而在罗切斯特面前感到自卑，相反的，她认为他们是平等的不应该因为她是仆人,而不能受到别人的尊重.使得罗切斯特为之震撼的是她的正直,高尚，纯洁，心灵没有受到世俗社会的污染。

并把她看做了一个可以和自己在精神上平等交谈的人，而慢慢地深深爱上了她。

他的真心,让她感动,她接受了他.而当他们结婚的那一天，简.爱知道了罗切斯特已有妻子时,她觉得自己
必须要离开，她这样讲，“我要遵从上帝颁发世人认可的法律，我要坚守住我在清醒时而不是像现在这样疯狂时所接受的原则”，“我要牢牢守住这个立场”。

这是简爱告诉罗切斯特她必须离开的理由，但是从内心讲，更深一层的东西是简爱意识到自己
受到了欺骗，她的自尊心受到了戏弄，因为她深爱着罗切斯特,试问哪个女人能够承受得住被自己最信任,最亲密的人所欺骗呢?简爱承受住了,而且还做出了一个非常理性的决定.在这样一种非常强大的爱情力量包围之下，在美好，富裕的生活诱惑之下，她依然要坚持自己作为个人的尊严，这是简爱最具有精神魅力的地方。

小说设计了一个很光明的结尾——虽然罗切斯特的庄园毁了，他自己也成了一个
残废，但我们看到，正是这样一个条件，使简爱不再在尊严与爱之间矛盾，而同时获得满足——她在和罗切斯特结婚的时候是有尊严的，同时也是有爱的。

在这里，我看到的不仅仅是一个如何赢得了男贵族爱情的平民女子的灰姑娘的故
事，而是勇敢的走出了灰姑娘的童话，迈向一个有着新女性、真女性的文学道路的起步。

简·爱藐视财富，但她却认为，“真正的幸福，在于美好的精神世界和高尚纯洁的心灵”。

我尊重作者对这种美好生活的理想——就是尊严＋爱，毕竟在当今社会，要将人的价值＝尊严＋爱这道公式付之实现常常离不开金钱的帮助。

人们都疯狂地似乎为了金钱和地位而淹没爱情。

在穷与富之间选择富，在爱与不爱之间选择不爱。

很少有人会像简这样为爱情为人格抛弃所有，而且义无反顾。

《简爱》所展现给我们的正是一种化繁为简，是一种返朴归真，是一种追求全心付出的感觉，是一种不计得失的简化的感情，它犹如一杯冰水，净化每一个读者的心灵。

简爱读书心得1000字五：
简·爱是个孤儿，从小寄养在舅母家中，受尽百般欺凌。

后来进了慈善学校洛伍德孤儿院，灵魂和肉体都经受了苦痛的折磨。

也许正是这样才换回了简·爱无限的信心和坚强不屈的精神，她以顽强的意志以成绩优秀完成了学业。

为了追求独立生活，她受聘在桑菲尔德庄园任家庭教师。

故事的重点是身份低下的家庭教师简·爱与男主人罗切斯特之间历经磨难的爱情。

这段爱情因男女主人公悬殊的社会地位和个性的差异而充满了激烈碰撞，也因两人志趣相同、真诚相爱而迸发出灿烂的火花。

作者以简·爱鲜明独特的女性视角和叙事风格娓娓道来，真实而有艺术感染力。

特别是简·爱的独特个性和思想，爱是一个不美的，矮小的女人，但她有顽强的自尊心。

在打动身为贵族的男主人公的同时，也紧紧抓住了我们读者的心。

简·爱作为爱情小说的女主人公是以前所未有的女性形象出现在这部十九世纪的文学作品中的。

以往爱情故事的女主人公都是些美丽温柔、高贵贤淑的女子形象。

而简·爱，她"贫穷，低微，不美，矮小"，但她拥有的一颗智慧、坚强、勇敢的心灵，使那些外在的美在这内在美面前黯然失色。

更为可贵的是简·爱并不因为自己的贫穷和外貌而自卑，相反，她勇敢坚定:"我和你的灵魂是平等的。

""我跟你一样有灵魂，--也完全一样有一颗心!""我现在不是凭习俗、常规，甚至也不是凭着血肉之躯跟你讲话--这是我的心灵在跟你的心灵说话，就仿佛我们都已离开了人世，两人一同站立在上帝的跟前，彼此平等--就像我们本来就是的那样!"
也正因为此，简·爱敢于去爱一个社会阶层远远高于自己的男人，更敢于主动向。