植物组织培养实验

植物组织培养
实验室基本设备：超净工作台；培养室、；洗涤、消毒室，卧式高压消毒锅；温室（培养大棚）；
常用仪器：1.蒸馏水器（学习操作），2.手提式高压消毒锅、卧式高压消毒锅（学习使用、操作），3.天平：⑴药物天平（工业天平）、粗天平、（精密度1/10）⑵分析天平（精密度1/10000），4.超净工作台（学习、使用、操作），5.电热干燥箱（烘箱），6.恒温光照培养箱（学习、操作），7.电冰箱，8.显微镜和解剖镜：①手提式解剖镜（学习、使用、操作）②立体解剖镜③普通显微镜，9.旋转培养机，10. 离心机（学习、使用、操作），11. 酸度测定仪：⑴精密PH4－7 试纸；⑵笔型袖珍酸度计。

必要的器皿：（一）玻璃器皿：1.培养器皿：①试管②三角烧瓶（锥形瓶）③圆形高形培养瓶（罐头瓶）④培养皿⑤扁身培养瓶⑥L 型和T 型管⑦凹面载玻片，2.盛装器皿：①试剂瓶②烧杯，3.计量器皿①量筒②容量瓶③吸管，4.其它器皿滴瓶、称量瓶、漏斗、玻璃管、注射器等实验室常用器皿。

（二）金属器械：1.镊子类：①20－25cm 长型镊子（接种或转移愈伤组织）②尖端弯曲“枪型”镊子（镊取较小的植物组织）③尖头钟表镊子和鸭嘴镊子（剥离表皮用）④尖端为小铲状镊子（挖取带琼脂培养基的培养物），2.解剖刀和刀类：①眼科用刀种牛痘疫苗的菱形刀（切割柔软组织中小细胞团）②解剖刀（手术刀）③双面刀片焊接在玻棒上（切取茎尖用）④锋利小刀、大刀和小铁锹，3.剪刀类：①解剖剪②眉剪③眼科剪④18－25cm 弯头剪
⑤俢枝剪，4.接种针。

几种常用药剂的配制：（一）用95%尝试酒精配比不同浓度的酒精的配制。

学习配制70%和75%酒精。

（二）消毒剂:1. 20%次氯酸钠溶液：称取20g 次氯酸钠用少许水溶解，100ml 水定容。

2. 0.1%升汞（HgCl2）溶液：称取0.1g HgCl2少许水溶解，100ml水定容。

（三）洗涤剂:1. 2HCl酒精：95%酒精100ml 加入2mlHCl，2.硫酸－重铬酸钾洗液：取10g 重铬酸钾加入蒸馏水90ml，加热溶解冷却后，逐渐加入浓硫酸175ml，放入棕色玻璃瓶备用，（注意：切记不可将盛过洒精，甲醛等原剂的药品玻璃器皿直接泡入洗液在，因为重铬酸钾是一种强的氧化剂，一旦被还原氧化，洗液变绿，失去洗涤作用）。

这些器皿必须用自来水冲洗干净并晾干再浸入洗液。

（四）1 摩尔浓度（mg/L）NaOH和1 摩尔浓度（mg/L）HCl 配制。

摩尔浓度是指用 1 升（1000ml）溶液中所含溶质的分子量数来表示的溶液的浓度。

用M 表示。

1.NaOH 摩尔浓度（M）
NaOH 摩尔质量=分子克数=40g
1M NaOH 是指1000ml 溶液中含有40 克摩尔质量的NaOH，现要配制100ml
（0×0.1＝4g）称取NaOH4g，用少量水解，定容至100ml.
2.HCl 的摩尔浓度
具体配制酸的mol 浓度时，应考虑原浓酸的比重mol 浓度。

要求配制的m ol 浓度×需配制的体积×原酸分子量
V＝————————————————————
原酸的百分浓度×原酸的比重×1000
配制 1.0M HCl100ml，量取38%，比重为 1.19 的HCl8.06ml 加蒸馏水，定容至100ml。

MS 培养基母液配制（单位：毫克mg）:
注意：1．大量元素按照使用时浓缩10 倍的数值称取，分别将各种化合物称量后，除CaCl2•2H2O 单独配制外，其余化合物混合在500ml烧杯中加适量蒸馏水溶解，用玻璃棒搅拌促溶，倒入1000ml 容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，置小口瓶中保存，贴上标签注明化合物名称（或编号），浓缩倍数，配制日期和配制者姓名，CaCl2•2H2O配制同上置于另一小口瓶中。

2．微量元素母液的配制按要求浓缩100 倍的数值称取，分别将各种化合物称量除铁盐（FeSO4•7H2O和Na2-EDTA.2H2O）作为一组单独配制外，其余化合物可混合置于烧杯内加少量蒸馏水溶解后，定容在1000ml容量瓶中，置小口瓶中保存，贴上标签。

3．铁盐配制将FeSO4•7H2O和Na2-EDTA.2H2O分别溶于450ml蒸馏水中，加热，不断搅拌，溶解后，两液混合，调pH至 5.5 加水定容至1000ml，置于小口瓶中，贴上标签。

4．有机物母液配制，按母液要求浓缩100 倍，除蔗糖按3%单独临时称量外，其余分别称量后，溶解，定容在500ml 容量瓶中，置于小口瓶中保存，贴上标签。

5．母液最好在2~4℃的冰箱中贮存，特别是有机类物质，贮存时间不宜过长，无机盐母液最好在一个月内用完，如发现有霉菌和沉淀产生，就不能再使用。

6．制备母液和营养培养基时，所用蒸馏水或无离子水必须符合标准要求，化学药品必须是高纯度的（分析纯）。

7．称量药物采用高灵敏度的天平，每种药品专用一药匙。

五. 作业
（1）将本次实验内容整理成实验报告。

（2）能不能把所有的母液置于一个瓶里，当作一种母液用于配制？为什么？
（3）在配制大量元素母液时，CaCl2为什么要单独配制？
（4）已知大量元素的母液浓度是原配方浓度的10 倍，在配制1000mlMS 培养基时应取多少毫升母液？
（5）MS 培养基中需加入0.5mg/L 的6-BA，当母液浓度为0.1mg/ml 时，配制1000ml 培养基需要取多少ml6-BA 母液？
配制培养基: 1. 琼脂称取8g 琼脂，加入300ml 蒸馏水，加热溶解直至完全溶解为止。

2.蔗糖3%：称取30g 蔗糖，溶于溶有琼脂的300ml 蒸馏水中。

3. 各种母液的吸取:
（1）用50ml量筒量取大量元素母液（A）和CaCl2•2H2O母液（B）各100ml
（2）分别用10ml 移液管或吸管吸取微量元素（C），铁盐（D）母液各10ml
（3）用10ml 移液管或吸管吸取有机物（H）10ml
（4）用2ml 移液管吸取生长素NAA1.5ml；用0.5ml 移液管吸取KT0.5ml
将上述溶液全部混合于琼脂与蔗糖溶液中，混合均匀后，加热至80℃左右，用酸度计或精密pH 试纸测定培养基的pH 一般要求 5.8~6.0，过酸过碱则用1N NaoH 和1N HCl 调整。

分装：用一个接有胶管的分装器趁热装培养基，1000ml 培养基分装70 支试管，即每支试管15ml 左右（一般占试管、三角瓶容量1/4~1/3 左右）注：培养基勿碰试管壁。

包装：分装好的试管用棉塞塞上，包上包装纸，每5~7 支试管捆成一扎，标明培养基代号即可进行灭菌。

①MS+2mg/L 2，4-D +0.8%琼脂（PH5.8）；
②MS+0.5mg/L 2，4-D +0.5mg/L6-BA+0.8%琼脂（PH5.8）；
③MS+0.5mg/L 2，4-D +1.0mg/L6-BA+0.8%琼脂（PH5.8）；
④MS+2 mg/L 2，4-D+0.5mg/L6-BA +0.8%琼脂（PH5.8）；
⑤MS+2mg/L 2，4-D +1.0mg/L6-BA+0.8%琼脂（PH5.8）
幼叶培养:
方法步骤
1. 接种前半小时，可用75%酒精或新洁尔灭喷洒，地板用湿拖把拖刷。

超净工作台在接种前用95%酒精揩抹工作台面和有关用具，并先开机鼓风15 分钟后才能使用。

2. 外植体的选择、分离：1．选择无病害的植物叶片（可选择不同种植物叶片）2．用单面刀片或剪刀，解剖刀把叶片从植株上剥离下来，剪成小段置于烧杯中。

3. 外植体的灭菌:超净工作台上将70%酒精倒入装有叶片的烧杯内消毒30s，然后将10%次氯酸钠溶液倒入烧杯内灭菌10 分钟，用无菌水将叶片冲洗三至四次。

4. 外植体的接种与培养:用经过灭菌的剪刀将叶片剪成0.5-1cm2大小的小块置于经过灭菌的培养皿中，打开培养瓶盖子（或试管塞子）用经过灭菌的镊子将外植体置于培养容器内，让外植体与培养基紧密接触，然后盖上盖子并拧紧(或塞上塞子)写上接种日期和外植体名称即转入培养室内培养，室内温度25~30℃，光强为1000~2000LUX,每天光照约14 小时。

约一周后观察愈伤诱导情况。

种子培养:
材料、仪器与试剂:1、光照培养箱、超净工作台、2. 三角瓶、培养瓶、镊子、封口塑料、皮筋等3. 1/2MS 或MS 固体培养基、70%酒精、15%的84 消毒液、0.1％的Tween、无菌水等。

方法步骤：1. 选取饱满完好的植物种子；以下步骤均在超净工作台上进行。

2. 将选好的植物种子放入100mL 的三角瓶中，加入70％的酒精浸泡不超过1min ；
3. 沥去酒精后，加入15％的84 消毒液＋0.1％Tween 消毒10 分钟（因品种而异，一般在8-15min）；
4. 沥去消毒液后，用无菌水冲洗3~4 次。

5. 沥干水份，将种子均匀植入1/2MS 固体培养基中，24℃，光强1500lx，光照16h/d。

茎段培养：
材料、仪器与试剂
1. 材料：菊花嫩枝或月季嫩枝
2. 仪器：超净工作台、灭菌锅、显微镜、剪刀、长镊子、烧杯（500ml）、培养皿、移液管等
3. 试剂：配制好的MS 培养基各种母液、1mol/L 的NaOH、1mol/LHCL 、0.1%的升汞。

①MS+0.2mg/LNAA + 0.8%琼脂（PH5.8）；
②MS+0.2mg/LNAA +0.25 mg/L6-BA+ 0.8%琼脂（PH5.8）；
③MS+0.2mg/LNAA +0.5 mg/L6-BA+ 0.8%琼脂（PH5.8）；
④MS+0.2mg/LNAA +1 mg/L6-BA+ 0.8%琼脂（PH5.8）；
⑤MS+0.2mg/LNAA +1.5 mg/L6-BA+ 0.8%琼脂（PH5.8）
方法步骤
1. 材料的选择；选用的枝条要求表面光滑、无病虫害。

2. 培养步骤：
（1）材料的灭菌：选取长约10 厘米的菊花嫩枝或月季嫩枝于0.1%的升汞溶液中表面消毒15 分
钟，然后用无菌水冲洗 3 次。

（2）用剪刀将灭菌后的枝条剪成1-1.5 厘米长、带一个芽的小段。

打开培养容器盖子，将茎段按其自然极性方向垂直插入培养基，盖好培养容器盖子，置于超净台上适当位置。

对接种用具、超净台面、操作者手等进行适当灭菌处理，继续接种。

如此操作，直至完成。

（3）培养条件：培养物置于25。

C 左右的培养室中，每天光照12 小时，光照度为850-1200lx。

根的离体培养：
材料、仪器与试剂
1. 材料：大而新鲜的胡萝卜
2. 仪器：超净工作台、灭菌锅、显微镜、解剖刀、刮皮刀、不锈钢打孔器、长镊子、烧杯（500ml）、培养皿、移液管等
3. 试剂：培养基（MS+10mg/L2，4-D+2mg/L6-BA）、70%乙醇、2%的次氯酸钠溶液四、方法步骤
1. 将胡萝卜用自来水冲洗干净，用刮皮刀除去表皮1-2mm，横切成大约10mm 厚的切片。

以下步骤均在无菌条件下进行。

2. 胡萝卜片经70%乙醇处理30 秒钟后，用无菌水冲洗一遍，再用、2%的次氯酸钠溶液浸泡10分钟，无菌水冲洗3~4 次。

3. 将胡萝卜片放入培养皿中，一手用镊子固定胡萝卜片，一手用打孔器垂直打孔，每个小孔打在靠近维管形成层的区域，务必打穿组织。

然后从组织片中抽出打孔器，将胡萝卜组织片收集在装有无菌水的培养皿。

重复打孔步骤，直至收集到足够数量的组织圆片。

4. 用镊子取出组织圆片，放入培养皿中，用刀片将组织圆片切成2mm 长的小块，放入装有无菌水的培养皿中。

在整个操作过程中镊子和解剖刀要多次火焰消毒，冷却后再使用。

5、将胡萝卜组织小块放到灭过菌的滤纸上，吸干水分后接种到培养基表面。

注意接种时培养瓶要有一定倾斜度，接种过程中镊子不要直接在培养基上方完成，以减少污染机会。

6、将培养物一部分置于25。

C 温箱中暗培养，另一部分到光照培养室中进行培养，以比较光照和暗培养对愈伤组织诱导的反映。

烟草愈伤组织，胚状体继代培养：
烟草嫩叶接种在诱导培养基上一周后便逐渐形成愈伤组织，为保持愈伤组织的旺盛生长，一般约3~4 周将愈伤组织进行继代培养，继代培养控制在10 代左右方法：
1．在无菌条件下，用无菌的镊子（或接种针）从培养瓶中取出愈伤组织，将它们放在无菌的培养皿中。

2．用无菌解剖刀把每块愈伤组织分割成若干小块（一般不小于5mm×5mm）并把已坏死的区域弃去。

3．用无菌镊子将小块愈伤组织放入新鲜的培养基上，每瓶（或管培养基可以放3~5 块，盖上盖子）（或塞上塞子）后置于培养室中继代培养烟草细胞胚状体的发生，有 2 种途径：
一是直接由烟草嫩叶（或芽）的愈伤组织产生，烟草嫩叶离体培养10~15 天，可看到蔗叶边缘愈伤组织上长出松散的、黄白的颗粒的胚性细胞团，并可在原培养基上下经转移直接发育成小植株；二是通过愈伤组织挑选胚状体细胞团从中筛选胚性细胞无性系，在继代繁殖培养中产生大量的胚状体，前者产生胚状体频率低，后者产生胚状体的频率高。

采用固体培养或液体培养
培养基：MS+NAA1-4mg/L+KT1. 3mg/L+蔗糖3%+琼脂0.8%（液体不加）PH5.8~6.0 都可育出胚性细胞无性系。

分化成苗培养：
从外植体形成器官或细胞无性系的形态发生，有两种方法，一种是不定芽方式，指细胞或愈伤组织培养物，通过形成不定芽再生成植株这是细胞和组织培养中常见的器官发生方式，有三个不同生长阶段——第一阶段，细胞和离休外植体脱分化形成愈伤组织；第二阶段，愈伤组织中形成一些
分生细胞，继而形成植株结构；第三阶段是器官原基的形成。

器官原基是由一个或一小团分生细胞分裂而形成的，这些分生组织块只有在一定条件下，逐渐能见到构成器官的纵轴上表现出单向极性，从而分化出芽和根，另一种是胚状体方式，指由培养细胞或组织诱导分化出具胚芽和胚根的胚状体结构（胚状体）进而发育成完整植株。

影响愈伤组织分化成器官要在一定合适的条件下才能实现，这些条件中，培养的生长调节剂种类及浓度和营养成分等具有重要作用，其他如光照、温度、PH 等也有一定关系。

试验证明形成器官的类型受培养中两种激素的相对浓度的控制，较高浓度的KT（细胞分裂素）则促进芽的形成而抵制根的形成，反之，较高浓度的生长素有利于根的形成而抵制芽的形成，6-BA、ZT(玉米素)和Zip（N-异戊烯
氨基嘌呤）等具有与KT 相同的作用，而且效力更大，并被广泛应用，试验发现激动素（KT）促进芽的发生，并非浓度越高越好，而是有一合适的范围，在有较高浓度的IAA 和IBA 好，但用IAA 和IBA 处理，产生的根比较健壮,而用NAA 的产生的根较纤细，2，4-D 往往对生根不利，特别是在较高的浓度下，KT 玉米素（ZT）和BA 均能促进芽的形成，其中BA 的效果最好，玉米素的作用范围较窄，通常都采用BA 和KT 来诱导芽的发生。

诱导愈伤组织形成的生长素水平往往对愈伤组织的器官发生也有影响，如高浓度2，4-D或其他生长素诱导的愈伤组织，通常结构疏松，器官发生能力较差，如果在诱导愈伤组织形成时，加入适量细胞分裂素，对其器官发生的状况，便会有所改善，近来，在愈伤组织器官发生中，已开始较多的使用ABA（脱落酸）、GA3（亦霉素），ABA 对芽分化有促进作用已得到广泛的实验证明，GA3对芽的发生并未见有直接促进作用的报道，但对芽的生长有良好作用。

诱导生根对培养基中无机离子浓度的要求低一些，故常用White 二分之一MS 培养基，同时有的情况下对某些离子的形式也有不同要求，如对氮的要求，有的植物要求硝态氮，而有的植物则提供氨态氮为佳。

此外，某些微量元素对器官分化有明显影响，如Fe 对烟草花药培养对其胚状体的形成，有良好作用，其它元素如Zn、Mn 等均不能代替Fe 的作用。

培养基中通常有机物有足够的糖、硫胺素、吡哆醇、烟酸、肌醇、甘氨酸等，可以满足愈伤组织的生长和分化的要求；此外，还可以加入适量的其他成分，如某些氨基酸，嘌呤和嘧啶等类物质，对器官分化有促进作用。

糖的种类和浓度对培养组织的增殖及以后的器官分化均有明显的影响，它不仅是碳源和能源，而且也是培养基的渗透势调节剂，通常在培养基中加2~3%的蔗糖可满足需要。

在培养基中添加一些天然的植物提取液，如椰子汁、麦芽汁、酵母提取物，番茄果汁、荸荠汁、马铃薯块茎提取液，幼嫩玉米汁等对器官分化常有良好效果。

其中最常用的是椰子乳汁（CM），这些汁液最主要作用是提供了一些生理活性物质，其次是补充了一些未知的微量成分。

通常对于组织培养中器官发生并不需要很强的光照，花药培养中大量实践证明了这一点，各种植物的组织培养的器官发生不需要光，但在组织培养过程中进行分化培养时，通常都是在一定光照下进行的，因为它至少对绿苗的形成、根的发生、枝的分化和胚状体的形成有促进作用，特别是芽发生后，应给予适当光照，但光（尤其是较强的光）对根的发生以后生长，往往有一定的抵制作用，故通常在生根培养基中添加适量的活性炭，对培养容器的基部盖以黑纸。

光照长度对具有敏感的光周期反应的植物的组织培养物的器官发生有明显的影响。

温度一般均用25-28℃恒温条件，培养室的温度最好能保持一定的昼夜温差，白天高，夜晚低，这对器官发生和生长均有利。

在组织培养中，必须及时转移已形成的较幼嫩的生长旺盛的愈伤组织至分化培养基上，可大大提高苗的分化频率。

愈伤组织的继代次数对器官分化影响很大，特别是一些禾谷类作物，苗的分化频率随愈伤组织的继代次数而逐渐下降。

培养物的生根培养：
植物离休培养物（无菌试管苗）根的发生都来自不定根，根的形成从形态上分两个阶段即根原基形成和根原基的伸长和生长，影响植物离体培养生根的因素很多。

有离体材料自身的生理生化状态，也有外部的条件因素。

一般木本植物比草本植物难，成年树比幼年树难，乔木比灌木难，外部因素：（1）基本培养基：大多数使用低浓度的MS 培养基，其中使用1/2MS 或1/3MS 培养基，降低无机盐浓度有利于生根，加铁盐则更好，微量元素中以B、Fe 对生根有利，糖的浓度通常采用低浓度一般在1%-3%；（2）植物激素：采用单一种生长素的占51.5%，生长素加激动素占20.1%，愈伤组织分化根时，使用NAA 最多浓度为在0.02-o.6mg/L 为多，使用IAA+KT 的浓度范围为0.1-4 和0.01mg/L 而以1-4 和0.01-0.02mg/L 居多数，而要胚轴、茎段插枝等材料分化根时使用IBA 居首位，浓度为0.2-10mg/L 以1mg/L 为多，可见生根培养多数使用生长素，大都以IBA、IAA、NAA 单独用或配合使用或与低浓度KT 配合使用，NAA 与细胞分裂素配合时摩尔比在20-30：1 为好。

不定根形成，其中激素起决定性作用，生长素却能促进生根，一般赤霉素、细胞分裂素、乙烯通常利于生根，如与生长素配合，一般其浓度均低于生长素浓度，脱落酸（ABA）可能有助于生根。

近年来为促进试管苗的生根，改变了通常将激素预先添加在培养基中的做法，而是将需生根材料在一定浓度激素中浸泡或培养一定时间，然后转入无激素培养基中培养，能显著提高生根率，如苹果新梢预先在IAA 溶液中浸泡1 小时，这样比预先加到培养基中效果好。

组培苗的移栽驯化：
组织培养中培育出来的苗通常称为组培苗或试管苗。

由于试管苗是在无菌、有营养供给、适宜光照和温度近100％的相对湿度环境条件下生长的，因此，在生理、形态等方面都与自然条件生长的正常小苗有着很大的差异。

所
以必须通过炼苗，例如通过控水、减肥、增光、降温等措施，使它们逐渐地适应外界环境，从而使生理、形态、组织上发生相应的变化，使之更适合于自然环境，只有这样才能保证试管苗顺利移栽成功。

1．准备工作
(1) 选择育苗容器组培苗移栽驯化一般用穴盘，经济实惠。

原苗移栽可选穴格、穴容稍大的，插扦苗可选二者较小的。

以节省空间，降低生产成本。

(2) 基质选配基质选配有其固定原则。

基质的作用是固定幼苗，吸附营养液、改善根际透气性。

组培苗的移栽一般用土栽培，为提高空间利用率选用穴盘的格小，容纳的营养介质少，因而对介质的要求高。

要求基质保肥，吸水力强，透气性好，不易分解，支撑性好。

采用泥炭、珍珠岩、蛭石、沙及少量有机质、复合肥混合调配为好。

(3) 场地、工具及基质灭菌、装盘移栽场地及所有工具必须用灭菌药水清洗（10％的漂白粉溶液，或800 倍的高锰酸钾液泡10-15min）。

基质要先充分混匀，用1000 倍液百菌清喷雾，搅拌。

如果基质内含土壤，消毒更应严格。

(4) 营养液配制①营养液主要成分。

植物生长发育需要的大量元素有碳、氢、氧、氮、磷、钾、钙、镁、硫。

微量元素有铁、氯、锰、硼、锌、铜和钼。

②常用的盐类的来源。

配制营养液常用的盐类是由工厂提供的工业化合物。

微量元素用量少，也可用化学药品代替。

如：氮肥：硝酸钙、硝酸钾、磷酸二氢铵、硝酸铵、尿素、氮磷钾三元复合肥。

磷肥：磷酸二氢钾、硫酸钾、氯化钾、氮磷钾三元复合肥。

钙肥：硝酸钙、硫酸钙、过磷酸钙、石膏
2. 组培苗移栽
(1) 自然适应组培苗由试管内条件转入温室，暴露于空气中，环境落差大，需逐步适应。

一般要求从培养室内将培养瓶拿到室温下先放置 2 周左右，再打开瓶盖，置架上4-12h。

(2) 起苗、洗苗、分级将苗瓶置水中，用小竹签伸入瓶中轻轻将苗带出，尽量不要伤及根和嫩芽，置水中漂洗，将基部培养基全部冼净。

将苗分为有根苗和无根苗两类。

(3) 移栽拿起苗，用手指在基质上插洞，将苗根部轻轻植入洞内，撒上营养土，将苗盘轻放入洇苗池中，待水漫漫上洇。

洇透后，将盘放在传送带上，送入缓苗室。

无根苗需光蘸生根液再行移植。

若用栽苗机应按规定操作。

3. 组培苗扦插
(1)为加快繁殖，提高繁殖系数，还可将组培苗切段扦插繁殖。

a. 自然适应组培苗由试管内条件转入温室，暴露于空气中，环境落差大，需逐步适应。

将瓶苗转入温室，一般要求从培养室内将培养瓶拿到室温下先放置 2 周左右，再打开瓶盖，置架上4-12h。

b. 洗苗洗净的小苗每叶节切一段，基部向下扦插在洇足水的沙盘中。

如果苗不易生根，可先蘸生根粉，再扦插。

c. 移栽同试管苗移栽。

4. 幼苗驯化管理
组培苗移栽后送入驯化室，驯化室一般为防虫温室。

移栽后1-2 周为关键管理阶段，主要是光照、水分、通风、透气等方面。

本阶段需弱光、适当低温和较高的空气相对湿度。

高温季节简易温室气温回升快，应加强通风、透气，进行人工喷雾。

本阶段可适施薄肥，结合喷水喷施3-5 倍MS 大量元素液。

一周后每隔 3 天叶面喷施营养液一次。

由于空气湿度低，气温低，幼苗易感染立枯病．猝倒病、枯叶病，造成死亡，因此要及时喷药，防冶病虫害。

5. 组培苗驯化
(1)适宜的基质不同栽培基质对组培苗移栽成活率有显著影响
(2) 苗的生理状况影响试管苗移载成活率高低
(3) 温、湿度影响移载成活率组培苗比较纤弱，适应能力差，需经过逐渐地气候适应驯化。

高温季节应注意遮阳、保温、通风透气，并经常进行人工喷雾。

温度以l8-20℃，空气相对湿度保持在70％-85％为宜。

6.“绿化”炼苗
温室组培苗移栽成活1-6 周后，可逐渐移至遮阳大棚下进行“绿化”炼苗。

本阶段特点是幼苗由驯化、缓苗期进入正常的生长。

根系刚恢复生长，幼叶长大，嫩芽抽梢，肥水管理非常重要。

7. 成苗管理
苗床温、湿度要适宜，促、控结合，使苗木即不徒长，又不老化。

同时，还需根据气象预报，注意防寒、通风换气，确保苗木的正常生长发育。