重组DNA技术ppt课件

HindⅡ
GTCGAC CAGCTG
GTC CAG
+
GAC CTG
平端切口
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
GATCC G
粘端切口
DNA连接酶
①作用: 把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，
即将脱氧核糖和磷酸连接起来.
②作用原理：
催化磷酸二酯键形成
③类型：
类型
来源
相同点
功能 差别
E·coliDNA连接酶 大肠杆菌 恢复 只能连接黏性末端
磷酸
T4DNA连接酶
T4噬菌体 二酯键
能连接黏性末端和 平末端(效率较低)
重组DNA技术中常用的工具酶
工具酶
功
能
限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割DNA
DNA连接酶
催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸 二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接
目的 ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物〔蛋白质）
（二〕工具酶
❖ 限制性核酸内切酶 ❖ DNA聚合酶Ⅰ ❖ 逆转录酶 ❖ T4DNA连接酶 ❖ 碱性磷酸酶 ❖ 末端转移酶 ❖ Taq DNA聚合酶
限制性核酸内切酶
定义 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周 围切割双链DNA的一类内切酶。
DNA聚合酶Ⅰ
Klenow片段 反转录酶
多聚核苷酸激酶
① 合成双链cDNA分子或片段连接 ② 缺口平移制作高比活探针 ③ DNA序列分析 ④ 填补3´末端
又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53 聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于 cDNA第二链合成，双链DNA 3末端标记等
（一〕疾病基因的发现
1990年美国科学家率先启动人类基因组计划 〔HGP），计划历时15年，至2019年完成；
2019年2月12日由Since和Nature杂志同时 向世界宣布，人类基因组3X109bp的最新图谱， 约含3 4万个基因；
整个人类基因组的全部核苷酸序列不久即将 完成。但要揭示人类4万个基因功能的任务将更
① 合成cDNA ② 替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析
催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针
末端转移酶
在3´羟基末端进行同质多聚物加尾
碱性磷酸酶 切除末端磷酸基
（三〕目的基因
❖ cDNA (complementary DNA) ❖ 基因组DNA (genomic DNA)
（四〕基因载体
5. γ干扰素
治疗癌症、病毒感染
6. 人组织纤溶酶原激活因子(tPA) 溶解血栓，治疗 急性心肌梗塞
7. 红细胞生成素 (Epo) 红细胞及血色素水平
治疗肾病性贫血，增加
（三〕基因诊断
基因诊断(genetic diagnosis)是利用分子生物学及 分子遗传的技术和原理，在DNA水平分析、鉴定遗传 疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。
酵母咪唑甘油磷 酸脱水酶基因
促进组氨酸合成
组氨酸缺陷 型大肠杆菌
无组氨酸 的培养基
λDNA
重组体
标 志 补 救
原 位 杂 交
Southern印迹
目录
小结：重组DNA技术操作的主要步骤
载体
目的基因〔外源基因）
质粒 噬菌体 病毒 基因组DNA
限制酶消化
开环载体DNA
cDNA 人工பைடு நAAAA TTTT
碱水解
TTTT
DNA聚合酶 Ⅰ
SI核酸酶
目录
（二〕克隆载体的选择和构建 （三〕外源基因与载体的连接
目的基因
限制性内切酶
载体
限制性内切酶
重组体
T4 DNA连接酶 15ºC
载体自连
目的基因 自连
目录
（四〕重组DNA导入受体菌
受体菌条件 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent)
↓ 把 Y F G 放 在 乳 球 蛋 白 的 启动子下
↓ 注入羊卵细胞→植入借腹怀 孕的母羊体内
↓ YFG在乳腺中表达
↓
生产蛋白质和多肽类活性物质
产品名称
治疗功能与医药范围
1. 人胰岛素
治疗糖尿病
2. 人生长激素
治疗侏儒症，加速创口愈合
3. α干扰素
治疗癌症、病毒感染
4. β干扰素 炎
治疗带状疱疹，眼结、角膜
定义 为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达 有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。
常用载体 质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA
克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计 的载体称为克隆载体。
表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽 链而特意设计的载体称为表达载体。
方式 体细胞基因治疗 (somatic cell gene therapy) 性细胞基因治疗 (germ line gene therapy)
转基因动物研究基因治疗
（五〕遗传疾病的预防
1. 基因检测与产前诊断 2. 携带者测试 3. 症候前诊断 4. 遗传病易感性分析
一些特殊的病原体疫苗。如， （1） 乙型肝炎病毒疫苗〔HBV）、丙型肝炎病毒疫
苗〔HCV〕等； （2） 有诱发致癌或产生免疫病理作用的疫苗，如人
T细胞免疫缺陷病毒〔HITV-1〕等； （3） 常规效果较差的疫苗，如霍乱和痢疾疫苗等 （4） 制备一些多价疫苗等。
动物药厂 通过转基因动物生产感兴趣 的基因
限制性核酸内切酶
切割DNA分子实质是 断开两个核苷酸之间的 磷酸二酯键。
DNA分子
限制酶的识别序列：
分类 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
作用 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统， 限制外源DNA， 保护自身DNA。
Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome)
GGATCC CCTAGG 切口 ：平端切口、粘端切口
人类基因组图谱的初步完成，不仅为全 部基因的定位建立了一个开放框架，而且为 分离、鉴定人类疾病相关基因提供了参照模 板。
如已知人类遗传性疾病约有3000种，推测 可能是由于某些基因结构异常或基因位移等 突变所致。如果利用分子生物学技术，将患 者疾病基因与正常基因图谱作对照分析，必
（二〕生物制药
制备基因工程疫苗 基因工程疫苗可以帮助解决传统技术难以解决的
目的基因
连接酶
重组体
转化 体外包装，转染
带重组体的宿主
挑选
表型筛选
酶切电泳鉴定
菌落原位杂交
基因工程的最终目的是通过载体将外源基因 导入合适的宿主细胞中高效表达，产生有重要价 值的蛋白质产品。
克隆基因表达条件： ⑴ 基因的编码区不能被插入序列中断; ⑵ 基因转录要有启动子，而启动子必须能被宿 主
细胞的RNA聚合酶有效地识别; ⑶ mRNA必须相当稳定，并有效地被翻译，产 生的外
重组DNA技术
DNA Recombination Technique
一、重组DNA技术相关概念
（一） DNA克隆
克隆(clone) 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。
获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)， 即无性繁殖。
技术水平：分子克隆(molecular clone) 即DNA 克隆 细胞克隆 个体克隆〔动物或植物）
组织或细胞染色体DNA 限制性内切酶
基因片断 克隆载体
重组DNA分子 受体菌
含重组分子的转化菌
* 从基因组DN有基 因组DNA的集合目录* 从cDNA获取目的基因mRNA 反转录酶
cDNA 复制
双链cDNA 载体
重组DNA分子 受体菌
基本过程 分别、扩增待测的DNA片断
区分或鉴定DNA的异常
规范 . 能正确扩增靶基因； . 能准确区分单个碱基的差别； . 本底或噪声低，不干扰DNA的鉴定; . 便于完全自动化操作，适合大面积、大人 群普查。
（四〕基因治疗
定义 基因治疗(gene therapy)是向有功能缺陷的细 胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基 因的缺陷，从而达到治疗的目的。
作为基因工程运载体的条件
①能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。 ②具多种限制酶切点，以便与外源基因连接。 ③具有某些标记基因，便于进行筛选。 ④载体是安全的，不能对受体细胞有害。 ⑤载体DNA分子大小应合适，以便提取和在体外进行 操作。。
常用的载体：质粒
有标记基因的 存在，可用含 氨苄青霉素的 培养基鉴别
导入方式 转化 (transformation) 转染 (transfection) 感染 (infection)
（五〕重组体的筛选
1. 直接选择法 (1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue) (3) 分子杂交法 原位杂交 Southern印迹
2. 免疫学方法 如免疫化学方法及酶免检测分析等
细菌。
载体：编码β-半乳糖 苷酶N端序列
宿主： 编码β-半乳糖 苷酶C端序列
（IPTG 存在下）
α-互补
细菌表达： β-半乳糖苷酶活性↑
5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal） → 形成蓝色菌落
当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→ 不能与宿主β-半乳糖苷酶的C端进行α-互补→产生白色菌落。
2. 真核表达体系 酵母、昆虫、乳类动物细胞
优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累 缺陷：操作技术难、费时、经济
转染 —— 将表达载体导入真核细胞的过程
方法：磷酸钙转染 DEAE葡聚糖介导转染 电穿孔 脂质体转染 显微注射
三、 重组技术在医学中的应用
有切割位点
能复制并带着 插入的目的基 因一起复制
目录
噬菌体(phage)
λ噬菌体DNA改造系统 λgt系列〔插入型，适用cDNA克隆） EMBL系列〔置换型，适用基因组克隆）
M13噬菌体DNA改造系统〔含lacZ基因） M13mp系列 pUC系列
二、重组DNA技术基本原理
基本原理
目的基因的获取 克隆载体的选择和构建
基础理论和技术发展促进了基因工程技术
1．基因转移载体的发现 2．工具酶的发现 3．DNA合成和测序技术的发明 ４．DNA体外重组的实现 5．重组DNA表达实验的成功 6．第一例转基因动物问世 7．PCR技术的发明
基因工程(genetic engineering) —— 实现基 因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程， 又称重组DNA工艺学。
外源基因与载体的连接 DNA导入受体菌
重组体的筛选
克隆基因的表达
以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程
目录
（一〕目的基因的获取
1. 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)
平板筛选
是指利用载体的遗传性标记在平板上直接筛选 的方法。
具有抗药性标记的载体，转化宿主细胞后， 能
在含抗生素〔Amp或Tet〕的培养平板上生长； 未转
化的则不能生长。
插入失活
当外源DNA序列插入质粒中某一抗药基因
(
抗 药插 性入 标失 记活 选法 择
目
)
2. 蓝-白筛选
利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的
源蛋白质必须不为宿主细胞的蛋白酶所降解。
1. 原核表达体系 （E.coli表达体系最为常用） 规范：选择标志 强启动子 翻译调控序列 多接头克隆位点 E.coli表达体系的不足 不宜表达真核基因组DNA 不能加工表达的真核蛋白质 表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 (inclusion body) 很难表达大量可溶性蛋白