蛋白酶的测定方法

蛋白酶活性
采用茚三酮比色法测定
1、试剂配制
①1%的酪素溶液：用 pH7.4 的 0.2M 磷酸盐缓冲溶液配制。

PH为7.4的0.2M磷酸盐缓冲溶液：0.2M 磷酸氢二钠（27.8g NaHPO4·2H2O溶于 1L 蒸馏水中）19ml 加 0.2M 磷酸二氢钾（53.65g KH2PO4溶于 1L 蒸馏水中）81ml 即成。

②0.1N 硫酸。

③20%硫酸钠。

④2%茚三酮液：2g 茚三酮溶于 100ml 丙酮。

⑤甲苯。

⑥甘氨酸标准溶液：取 0.1g 甘氨酸溶液水中，定容 1L，
则得 1ml 含 0.02mg 氨基氮的标准液。

再稀释 10 倍做成标准液。

标准曲线的绘制：分别吸取工作液 1,3,5,7,9,13ml 移于
50ml 容量瓶中，加 1ml 的茚三酮，冲洗瓶颈后在沸水浴上加热10min，将获得的着色溶液用蒸馏水稀释至刻度。

在风光光度计上于 500nm 处比色测定颜色深度。

以光密度为纵坐标，以氨基
氮浓度为横坐标，绘制曲线。

2、操作步骤
称 4g 风干土，置于 50ml 三角瓶中，加 20ml1%酪素溶液
和 1ml 甲苯，小心振荡后用木塞盖紧，在30℃恒温箱中培养 24h。

培养结束后，于混合物中加 2ml0.1N 硫酸和 12ml 20% 硫酸钠液，以沉淀蛋白质，然后离心 15min(6000 转/min)。

取上清液2ml，置于 50ml 容量瓶中，按绘制标准曲线显色的方法进行比色测定。

为了消除土壤中原来含有的氨基氮引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个实验需做无土对照。

无土对照：不加土样，其他操作与样品实验相同。

无基质对照：以等体积的水代替基质，其他操作与样品实验相同。

蛋白酶活性，以 24 小时后1g 土壤中氨基氮的毫克数表示。

3、结果计算
NH2-N(mg)=a×5
式中 a——从标准曲线查的氨基氮毫克数
5——换算成 1g 土的系数。