2023届高三生物一轮复习课件：基因工程

引物的作用：与两条模板链结合，使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
引物的种类：需2种引物。
为何需要2种引物？DNA的两条反向平行链都做模板，其碱基序列不同，且DNA聚合酶只能从3’端延伸子
链，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增
扩增n次需要多少个引物？
至少需经过3次循环才能分离得到所需要的DNA区段
淀物？析出的操作步骤？
3.1 重组DNA技术的基本工具
二、DNA连接酶 1.作用：将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。 2.分类：E.coliDNA连接酶：来源于大肠杆菌； 只能连接具有互补黏性末端的DNA片段
T4DNA连接酶： 来源于T4噬菌体； 既能连接双链DNA片段互补的黏性末端，又能连接双链 DNA片段的平末端（但连接平末端的效率较低）
5.PCR：
名称：聚合酶链式反应 原理：DNA半保留复制 仪器：PCR扩增仪（PCR 仪）
条件：①模板：DNA母链 ②原料：4种脱氧核苷酸 ③酶：耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）
④引物 ⑤缓冲溶液（含Mg2+）
缓冲溶液中添加Mg2+的作用？真核细胞和细菌的DNA聚合酶需要Mg2+激活。
过程：①变性：温度上升到至90℃以上时，双链DNA解聚为单链 ②复性：温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 ③延伸：温度上升到72℃左右时，4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补 配对原则加到引物的3’端，合成新的DNA链。
鉴定PCR产物的方法琼脂糖凝胶电泳
用PCR可以扩增mRNA吗？不可以，需要逆转录成cDNA再进行扩增
③引物长度不宜过短，防
两种引物的要求 ①引物自身不能环化 ②两种引物之间不能互补配对 止引物随机结合
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●当 真 核 生 物 的 基 因 以 原 核 生 物 作 为 受 体 细 胞 时 ： ●1 . 若 无 法 获 得 该 蛋 白 ， 原 因 可 能 是 什 么 ？ ●2 . 以 上 情 况 如 何 解 决 ？ ●3 . 若 可 以 获 得 该 蛋 白 ， 但 是 蛋 白 质 无 活 性 ， 原 因 可 能 是 ？ ●4 . 以 上 情 况 如 何 解 决 ？ ● 5.若原核生物由mRNA逆转录形成的cDNA与原基因的结构相比有哪些不同？ ● 6.若真核生物由mRNA逆转录形成的cDNA与原基因的结构相比有哪些不同？
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●1.基因表达载体的构建目的？ ●2.基因表达载体组成？ ●3.基因表达载体各组成部分的作用？ ●4.转化的概念？ ●5.将目的基因导入受体细胞的方法及适用范围？
第二步——基因表达载体的构建（核心）80
1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时能够表达和发挥作用。
2.组成：目的基因 ＋ 启动子 ＋ 终止子 ＋ 标记基因 + 复制原点
mRNA 终止翻译
1.启动子≠起始密码；终止子≠终止密码，密码子是mRNA上的，参与翻译过程
2.生物体内所有细胞（除哺乳动物成熟红细胞外）均具有相同的基因，但是有的基 因在所有细胞中都表达（如呼吸酶基因），但是有的基因只在特定细胞中选择性表 达（如胰岛素基因在所有体细胞中均存在，所以所有细胞中的DNA均可与胰岛素基因 探针形成杂交带。但是其仅在胰岛B细胞中表达，所以只在胰岛B细胞中能转录出相 应的mRNA，因此只有胰岛B细胞中的mRNA与胰岛素基因探针形成杂交带。）
● 4.基因表达载体的构建时选择限制酶的原则
3.1 重组DNA技术的基本工具--限制酶
1.主要来源：原核生物 a.限制酶在原核生物中的作用是什么？
限制酶在原核生物中起到的作用为：切割外源DNA、使之失效，以保证自身安全
b.限制酶不破坏自身DNA的原因是什么？
DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者DNA分子被修饰（甲基化），使限制酶不能将其切开
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2 位点，2都可以切割。。。。必刷题P44-T4、P47-T1
7.同尾酶切割后产生的黏性末端为何能够连接？ 因为同尾酶切割后产生了相同的黏性末端
8. 同尾酶切割后产生的黏性末端通过DNA连接酶连接后，该序列还能再被原来的酶识别和切割吗？不一定
9..用同一种限制酶切割后，会出现哪些连接情况？ ①目的基因—目的基因、 ②目的基因自身环化、
⑤目的基因—质粒、 ⑥目的基因—质粒反向连接
③质粒—质粒、
④质粒自身环化、
10.用两种限制酶切割后，会出现哪些连接情况？ 目的基因—目的基因、质粒—质粒、目的基因—质粒 11.用不同的限制酶切割：可以防止目的基因自身环化、质粒自身环化、目的基因和质粒反向连接 （或保证目的基因和质粒正确连接）
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● 1.DNA连接酶的作用？类型及特点？ ● 2.载体的种类？各自的用途？作为载体必备的条件？质粒的概念？ ● 3.DNA的粗提取与鉴定实验原理？过滤的方法？过滤后取上清液还是取沉
编码区
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●1.P C R 原 理 ？ 条 件 ？ 缓 冲 溶 液 中 添 加 M g 2 + 的 作 用 ？ 过 程 ？ 鉴 定 P C R 产 物 的 方法？用PCR可以扩增mRNA吗？
●2 . 引 物 的 作 用 ？ 要 求 ？ 为 何 需 要 2 种 引 物 ？ 扩 增 n 次 需 要 多 少 个 引 物 ？
1.反转录法
2.基因文库构建方法：直接分离法、反转录 法
1.逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA 互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；
2.核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的 RNA链，使之变成单链DNA；
3.以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作 用下合成另一条互补的DNA链，形成双 链DNA分子，即cDNA
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1.在培养有些转基因植物时，常用农杆菌转化法，农杆菌的作用是什么？ 2.原理？ 3.采用农杆菌转化法导入目的基因时，为什么目的基因可以整合到染色体的DNA 上? 4.目的基因插入染色体DNA上的目的是什么？ 5.两次拼接、两次导入 6.转基因的植物细胞如何获得最终的新品种？
三、将目的基因导入受体细胞
3.2 基因工程的基本操作程序
1.基因工程的基本操作程序？P76四步 2.基因工程操作环境：体外； 操作水平：DNA分子水平； 原理：基因重组； 3.不同生物DNA能够拼接的原理： 不同生物的DNA都是由脱氧核苷酸组成的，都是双螺旋结构 或（不同生物的DNA具有共同的空间结构和基本单位） 4.目的基因在受体细胞中表达出相同蛋白质的原理： ①基因是控制生物性状的基本单位。②遗传信息的传递都遵循中心法则。③生物界共用一套遗传密码。 5.Bt基因（Bt抗虫蛋白基因）表达出的Bt抗虫蛋白：P77右上角 杀死害虫的原理？Bt抗虫蛋白被分解为多肽，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿 孔，造成害虫死亡。
6.单酶切：容易出现反连和载体、目的基因的自连现象（即所谓环化）
双酶切：不同的酶作用于不同的碱基序列，得到不同的黏性末端，避免自身环化和反向连接
同尾酶：识别的靶序列不同，但是酶切后形成的粘性末端相同，可通过DNA连接酶连接，但一般不能再被
原来的酶识别和切割
1和2为同尾酶，黏性末端均为GATC，1可以切割的
（1）
：便于重组DNA分子的筛选
（2）
：DNA片段，基因上游，紧挨转录起始位点，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转
录出mRNA
（诱导型启动子----激活或抑制基因的表达）
（3）终止子：是一段有特殊结构的DNA片段 ，位于基因的下游，转录终止的信号
（4）复制原点：DNA复制开始的地方
载体与基因表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。 基因表达载体在载体基础上增加了启动子、目的基因、终止子
原核生物缺少高尔基体和内质网等细胞器，无法对真核生物的蛋白质进行正确的加工 4.以上情况如何解决？ 人工体外再加工或使用酵母菌等真核生物作为受体细胞
相似名词比较
比较项目
位置
功能
启动子 （其上有一个重要的位点：RNA聚合酶结合位点） DNA
驱动转录
起始密码子
mRNA 驱动翻译
终止子
DNA
终止转录
终止密码子
三、载体 1.载体的种类： 质粒（最常用）、噬菌体、动植物病毒 2.载体的作用：将目的基因送入受体细胞
3.质粒：一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力 的的双链环状DNA分子 4.作为载体必须具备的条件：①能在受体细胞中自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制
②具有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（目的基因）插入。 ③具有标记基因，便于重组 DNA分子的筛选 ④对受体细胞无害。 5.真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行人工改造的。
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● 1.基因工程的基本操作程序？基因工程操作环境？ 操作水平？ 原理？ ● 2.目的基因的筛选与获取方法？ ● 3.逆转录法的过程？ ● 4.基因组文库与cDNA文库的区别（
不会对人畜有害的原理？①Bt抗虫蛋白只在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人畜的胃液 呈酸性 ②人畜的肠道细胞没有特异性受体。 一、目的基因的筛选与获取 1.何为目的基因？P76用于改变受体细胞性状和获得预期表达产物的基因，主要指编码蛋白质的基因 2.目的基因的获取方法：人工合成、从基因文库中获取、PCR获取和扩增 3.cDNA文库是由mRNA逆转录形成的，只包含真核细胞基因结构中外显子的序列，可在不同物种之间交流；
思考： 当真核生物的基因以原核生物作为受体细胞时： 1.若无法获得该蛋白，原因可能是什么？ 真核生物的基因有内含子，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制，其 初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，因此无法表达出该蛋白
2.以上情况如何解决？
使用cDNA作为目的基因或使用酵母菌等真核生物作为受体细胞 3.若可以获得该蛋白，但是蛋白质无活性，原因可能是？
具有专
2.作用特点：识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。一性 3.识别序列： ①大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或
其他数量的核苷酸组成。无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴 线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，这就是回文序列。 ②能被限制酶特异性识别的切割部位基本都具有回文序列：在切割部位，一条链正向读 的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。 4.结果：产生黏性末端或平末端
1.转化：是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程
2.农杆菌转化法：
受体细胞：受精卵
Ca2+的作用：增加细胞壁的通透性 这种细胞称为感受态细胞
植物组织培养
思考： 1.在培养有些转基因植物时，常用农杆菌转化法，
原核细胞
真核细胞
不同点
编码区是_连__续__的
编码区是间隔的、不__连__续_的
相同点
都由能够编码蛋白质的_编__码__区___和具有调控作用的_非__编__码___区组成的
若原核生物由mRNA逆转录形成的cDNA与原基因的结构相比有哪些不同？ 缺少启动子和终止子
若真核生物由mRNA逆转录形成的cDNA与原基因的结构相比有哪些不同？ 缺少启动子、终止子、内含子
3.构建过程：需要限制酶和DNA连接酶的参与
选择限制酶的原则： ①选目的基因两端和载体都有限制酶的切割位点；可用同种限制酶或者产生相同末端的限制酶（同尾酶），同时切割 载体和含有目的基因的DNA片段， ②所选酶切位点不能破坏目的基因、标记基因（至少有一个完整）、复制原点、启动子、终止子 ③为避免目的基因和质粒的自身环化及目的基因与质粒的反向连接，可使用两种切割后能产生不同黏性末端的限制酶 来切割目的基因和质粒，确保目的基因和质粒正向连接。目的基因应插入启动子和终止子之间。
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● 1.限制酶来源?在原核生物中的作用是什么？不破坏自身DNA的原因是什么？ 作用特点？结果？
● 2.同尾酶概念？同尾酶切割后产生的黏性末端为何能够连接？同尾酶切割后 产生的黏性末端通过DNA连接酶连接后，该序列还能再被原来的酶识别和切 割吗？
● 3.用同一种限制酶切割后，会出现哪些连接情况？用两种限制酶切割后，会 出现哪些连接情况？用不同的限制酶切割的目的？