动物胚胎移植技术及体外受精

胞数量减少，经冷冻和解冻在体内和 体外的发育能力进一步降低，其移植 妊娠率低于完整的冷冻胚胎
三、胚胎嵌合体
由两个或两个以上具有不同遗传性
状的细胞或细胞系组成的聚合胚发 育而成的个体 原发性嵌合体 次生型嵌合体
1、方法
囊胚注入法
在动物胚胎发育到囊胚时，将
目的细胞或细胞团注入囊胚腔， 使之与内细胞团结合并发育， 最终得到嵌合体个体
延长黄体期：孕激素
控制卵泡的生长发育和发情表现 缩短黄体期：前列腺素 加速黄体退化，使卵巢提前摆脱体内 孕激素的控制 促进卵泡发育、排卵：促性腺激素
3）超数排卵
超排：以各种外源性促性腺激素诱发动物
卵巢的许多卵泡发育并排出具有受精能力 的卵子 孕母马促性腺激素、促卵泡素、前列腺素、 促排卵类药物、孕激素 超数排卵处理的时期应选择在发情周期的 后期，即黄体消退时期
A级和B级胚胎
胚胎的发育时期
多采用8细胞早期胚胎聚合
四、胚胎细胞核移植
•将未着床的早期胚胎分散成单个的细胞， 用电融合方法，使单个细胞与去除细胞 核的未受精的成熟的卵母细胞融合，体 外培养发育成胚胎后，移入受体妊娠产 子
•已在小鼠、兔、山羊、牛、猴等动物上 成功
五、性别控制与胚胎性别鉴定
个体对超排处理的反应效果难以预测 产生不良的后果：胚胎死亡 卵母细胞蛋白质合成过程发生改变 生殖道机能产生影响
4）胚胎回收
利用冲胚液从供体的生殖道中冲洗
出来，提供移植或其它胚胎工程用
手术法 非手术法
胚胎质量评价：
透明带的形态和完整性
胚胎的发育与胚龄是否一致
胚胎的形态与匀称性，胚内细胞大小的变化
•其它方面应用
胚胎移植是克隆技术的必须过程 体外受精必须借助胚胎移植实现“试
管婴儿的继续发育” 转基因及动物生物反应器的研究也必 须借助胚胎移植
二、胚胎分割技术
1）概念
采用显微手术（机械方法）的方法将 早期胚胎分割成2分胚，4分胚或8分胚，经体 内或体外培养后植入受体，以得到同卵双胎 或同卵多胎的技术
聚合法
全胚聚合法
将发育到一定时期的胚胎，去掉透明带
后，将两个或两个以上的胚胎聚合在一 起，形成一个胚胎后放入二氧化碳培养 箱中培养至囊胚，再植入受体动物体子 宫内
卵裂球聚合法
去掉透明带后将胚胎打散，从双方胚胎
卵裂球中各取出一部分细胞进行聚合， 培养后移植
2、影响因素
胚胎的质量与状态
在保护动物遗传资源，提高家畜生产性能，
挽救濒临灭绝的野生动物方面，胚胎移植技 术越来越发挥出重要作用 冷冻能够很好地保存濒临灭绝动物的胚胎或 生殖细胞，但该种动物雌性个体的减少，也 是这种动物的胚胎或生殖细胞无法得到移植， 科学家开始研究在该种动物的亚种或亲缘种 中试验，并取得一些成功，如斑马胚胎移植 给马，蒙古马胚胎移植给驴，白肢野牛移植 给荷斯坦牛
生产性能较差的个体或品种。
“借劣质动物之腹怀优秀个体之胎”
胚胎移植的基本程序
选择 供体母牛 受体母牛 ……同期发情处理……
超数排卵
供体公牛
配种
冲卵 胚胎移植 妊娠检查
质量检查、培养
分娩（胚胎移植的犊牛）
8)胚胎移植的应用范围
在家畜改良方面的应用
在特定品种扩繁上的应用
在动物生物多样性上的应用 其它方面应用：转基因动物、性
受体的同期发情处理
胚胎回收 胚胎检查 胚胎移植
1）供受体的选择与管理
供体的选择

遗传价值：生产性能优秀的母畜
健康状况:身体健康，营养水平中等以 上的未孕动物
繁殖性能：达到配种年龄以上繁殖机能 正常的母畜

受体的选择

身体健康，身体状况中上的适繁未孕个 体，无生殖道疾病和难产病史 繁殖状况正常，有正常的发情周期
•在特定品种扩繁上的应用
牛羊等低繁殖力家畜，从引进到形成一
个纯种群体需要7-8个世代，15-20年， 而采用MEOT法，一次就可获得一个纯种 群体 80年代初，美、澳、新从欧洲引进的大 型肉牛品种均采用胚胎移植技术扩繁 2000年前后，我国的波尔山羊也是采用 胚胎移植进行扩繁的
•在动物生物多样性上的应用
②胚胎分割技术也是动物克隆的方法之 一 ③胚胎分割的份数越多，操作的难度会越大， 移植的成功率也越低
• 早期胚胎的体积很小，只有在显微镜下才能看到 • 细胞数目是有限的：分割的份数越多，不但难以 做到均等分割，每一份的细胞数会越少，作为囊胚 期的胚胎内细胞团细胞所受的影响会更大 • 分割的份数越多，技术的难度会越大，移植后的 恢复和发育的难度会越大，移植成功率自然会降低
•胚胎冷冻的原理
胚胎冷冻实际是脱水的过程，冷冻
保存的关键是设法减少细胞内冰晶 对胚胎的损伤 冷冻过程中，水分形成冰晶造成细 胞机械损伤，同时，导致未结冰的 细胞内溶液渗透压急剧升高，造成 蛋白质变性，导致死胎 常规慢速冷冻法、玻璃化冷冻保持
7）胚胎移植
受精卵移植
一般供体为良种或优良个体，而受体为
供体和受体在分类学上的相同属性 动物生理上的一致性：受体和供体在发情时间上的同 期性 动物解剖位置上的一致性：空间环境的一致性

胚胎的发育期限：必须处于周期黄体期内 胚胎的质量：胚胎必须是正常的，并在处理过程中不受
不良因素的影响
3、胚胎移植
供受体的选择与管理 供体的超数排卵处理和配种
动物的性别控制(sex control)技术
是通过对动物的正常生殖过程进行 人为干预，使成年雌性动物产出人 们期望性别后代的一门生物技术
X、Y精子分离技术：流式细胞仪 胚胎性别诊断
早期胚胎的性别鉴定
1）核型分析：分析部分胚胎细胞
的染色体的组成
2）SRY片段的PCR扩增 Y染色体 上的特异 片段
胚泡形成
受精后第4~6天桑椹胚细胞继续分裂，细胞间 开始出现小腔隙，并逐渐汇合成一个大腔，桑椹胚转变为 中空的泡状，称胚泡（blastocyst），胚泡由三部分组成：
极端滋养 层
滋养层
胚泡 内细胞群
胚泡腔
一、胚胎移植
受精卵移植

把一头雌性动物的早期胚胎从输卵管或子宫 中冲洗出来，移植到另一头雌性动物的输卵 管或子宫内，使之继续发育成新个体的技术 提供胚胎的动物 接受和孕育胚胎的动物
④透明带对于分割胚体内外发育的影响
透明带作用：阻止异种动物精子受精和同
种动物的多精子受精，保护受精卵在输卵 管和子宫内正常运行，防止输卵管和子宫 液的伤害及白细胞的吞噬，并使分裂阶段 的卵裂球相互靠近，不致分离
胚胎分割时所处的发育阶段，对透明带的
依赖性越强
⑤冷冻胚胎的影响
分割过程引起的透明带损伤和胚胎细
源激素作用下，每个发情期的卵泡发育和排卵 数可达数十个 每个发情周期生殖器官都有一个孕向发育 早期胚胎处于游离状态 胚胎发育不存在免疫问题 胚胎发育到一定阶段会与子宫发生生理和组织 联系 胚胎的遗传性不受受体的影响
2. 胚胎移植的基本原则
胚胎移植前后所处的环境的同一性

细胞质的结构及颜色，胚内是否出现空泡，
细胞碎片，有无游离细胞 如A级： 为优良胚胎，形态典型，卵裂球轮廓清 晰，紧密充实，大小均一，细胞质致密，色 调和分布均一
6）胚胎的保存
胚胎的降温：使胚胎停止发育，延
长其体外生存时间 体外培养：将胚胎置于体温条件下， 在培养液中，使其继续发育 胚胎冷冻：通过一定的处理程序， 将胚胎降温冷冻后，保存于液氮中
胚胎分割以增加优秀遗传性状的动物数 量为主要目的，可提高胚胎移植技术的效率 和效益
2)基本过程：
选择良好的桑椹 胚或囊胚移入培 养皿中，用分割 针或分割刀片将 其切开，吸出其 中的半个胚胎注 入透明带中或直 接移植给受体
3）胚胎分割的理论依据
大多数哺乳动物早期胚胎属调整发
育类型，去掉早期胚胎的一半，剩 余的部分仍发育成完整的胚胎，至 少在8细胞前，每个分裂球都有相同 的发育能力 到晚桑椹胚时，胚胎发生初步分化， 这时进行胚胎分割，可以重新发育 到囊胚


母性良好：泌乳性能、护仔性能
供、受体的管理


防疫、记录
饲养管理等
2）同期发情 （synchronization of eatrus）
采用激素或类激素的药物处理，使这一
群母畜在特定时间内集中发情和排卵 即将母畜的黄体期延长或缩短，使母畜 摆脱内、外孕激素对卵巢的控制，在同 一时间内引起全部母畜的卵泡发育，从 而达到同期发情的目的
4）特点:
后代具有相同的遗传物质
胚胎克隆
5）使用的主要仪器： 实体显微镜和显微操作仪 6）应用: 为转基因技术、性别控制技术提 供活胚材料
注意： ①对囊胚阶段的胚胎进行分割时，要将内细胞 团均等分割 原因：内细胞团一般到囊胚阶段才出现，它是 发育为胚胎本身的基础细胞，其他细胞为滋养 细胞，只为胚胎和胎儿发育提供营养。若分割 时不能将内细胞团均等分割，会出现含内细胞 团多的部分正常发育的能力强，少的部分发育 受阻或发育不良，甚至不能发育等问题
别控制、体外受精
•在家畜改良方面的应用
人工授精技术可成几十到几百倍地提
高了优秀种公畜的配种效能，但对优 秀母畜来说，受其产仔数和世代间隔 的限制，尤其是牛羊等繁殖力较低的 畜种更是如此 通过超数排卵和胚胎移植技术 （multiple ovulation and embryo transfer: MOET)牛羊的生长性状年遗 传进展可比正常繁殖提高80%和70%； 产奶性状提高33%

胚胎移植的历史
实用化初始阶段
1970-1980 加美开始成立牛胚胎移 植公司，1973年牛冻胚移植成功（英） 实用化研究阶段 1982- 大规模胚胎移植、核移植、嵌 合体、胚胎分割、性别鉴定、体外受精 在英美日德广泛开展，克隆羊诞生

1.胚胎移植的生理学基础
成年母畜卵巢上存在数千到上万个卵泡，在外
意义
通过控制后代的性别比例，可充分发挥受
性别限制的生产性状(如泌乳)和受性别影 响的生产性状(如生长速度、肉质等)的最 大经济效益 控制后代的性别比例可增加选种强度，加 快育种进程 控制胚胎性别还可克服牛胚胎移植中出现 的异性孪生不育现象，排除伴性有害基因 的危害
六、早期胚胎培养
3）H-Y抗原：雄性特异性弱组织相容性Y抗 原
只有Y 精子才能表达H-Y抗原 利用H-Y 抗体检测精子质膜上存在的H-Y抗原，
再通过一定的分离程序，就能将精子分离成HY+(Y精子)和H-Y-(X精子)两类，将所需性别的 精子进行人工受精，即可获得预期性别的后代 测定胚胎上H-Y抗原的存在与否对胚胎的性别 作出鉴定
第一节 胚胎工程技术
胚胎移植 胚胎融合 胚胎分割 胚胎的冷冻保存
早期胚胎培养
胚细胞核移植
受精过程 ①分解放射冠的卵泡细胞 ②水解局部透 明带 ③ 精子细胞核和部分胞质进入卵母细胞
卵裂及胚泡形成（第一周）
卵裂(cleavage)
受精卵由输卵管向子宫方向运行，并不断进行细胞分裂，受精 卵早期的细胞分裂称卵裂；卵裂产生的子细胞呈球形，称卵裂 球（blastomere） 桑椹胚（morula） 受精后第3天，形成 了12~16个卵裂球组 成的实心胚，形似 桑椹，称桑椹胚
章
动物胚胎工程技术及体 外受精
现代生物技术
家畜育种领域
繁殖生 物技术
分子生 物技术
人工授精技术 超数排 卵和胚 胎移植
胚胎工程技术
胚胎性 别鉴定
体外 受精
胚胎 分割克隆 技术 Nhomakorabea试管婴儿
体外受精联合胚胎移植技术（IVF） 1978年英国专家steptoe和Edowrds定制了
世界上第一个试管婴儿 1978年7月25日世界第一例试管婴儿Louis Brown在英国诞生。IVF的最早阶段妊娠成 功率只有2.94％。 大陆首例试管婴儿郑萌珠于1988年3月10日 上午8点56分在北京医科大学第三医院诞生
供体

受体

胚胎移植的历史
初始阶段
1890-1900 W.Heape将安哥拉兔和荷兰兔的受精 卵分别移植到比利时兔的输卵管内，分别获得仔 兔2只 1900-1950 主要由英美科学家在家兔、绵羊、山 羊小家畜方面研究，成功率35%左右 发展阶段 1950-1970 日本首次在牛胚胎移植上成功，之后 日、美采用非手术法移植成功，胚胎移植成功率 达70-80%