血清及若干配方

有关血清的常见问题
血清是细胞培养中最重要的元素之一。

因此，我们特别整理了一些实验室里常会遇到的问题，供大家参考：1、保存血清最好的方法是什么？
我们建议血清应保存在-5℃至-2O℃。

但是，若存放于4℃时，请勿超过一个月。

若您一次无法用完一瓶，建议您无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。

反复冻融会对血清的品质造成不良影响。

2、如何解冻血清才不会使产品质量受损?
我们建议您将血清从冷冻箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之溶解，然后在室温下使之全溶。

但必须注意的是，溶解过程中必须规则地摇晃均匀。

3、血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理?
由于GIBCO血清在过滤之前，没有经过预老化(pre-aged)处理，所以在解冻过程（包括没有完全解冻）或储存在2-8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白（如凝集素、纤维蛋白原和玻连蛋白等）可能会聚集成团，形成絮状沉淀或外观混浊；在运输过程中，由于时间较长，所以往往有少许解冻，因此也可能稍有沉淀，但这些都不影响血清性能。

若您欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心,上清液即可接着加入培养基内一起过滤。

我们不建议您以过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞过滤膜。

4.何谓热灭活?
一般是以56℃，30分钟来处理已解冻的血清，因为此加热步骤，可以使补体去活化，而补体所参与的反应有:溶细胞，平滑肌的收缩，肥大细胞和血小板组胺的释放，增强吞噬作用，淋巴细胞、巨噬细胞的趋化和激活。

5、有必要做热灭活吗?
实验显示，经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。

经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。

而经过热灭活的血清，沉淀物的形成会显著增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察，像是“小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在37℃环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。

因此我们建议您，若非必须，您可以不做热灭活处理血清。

这样，不仅节省您宝贵的时间，更确保血清的质量。

只在做免疫学研究或培养干细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，才推荐做热灭活。

我公司也有已经热灭活的血清可供选择。

6、如何减少沉淀物的产生?
我们建议您在使用血清的时候，注意下列的操作:
·解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-20℃至4℃至室温)，若血清解冻时改变的温度太大(如-20℃至37℃)，实验显示非常容易产生沉淀物。

·解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生
·请勿将血清置于37℃太久。

若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。

·血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，则毋须做此步骤。

·若必须做血清的热灭活，请遵守56℃，30分钟的原则，并且随时摇晃均匀。

温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。

提醒你注意一下，细胞复苏是速度一定要快，尤其是在-5℃～０℃这阶段，因为在这个温度阶段细胞最容易受损，如果复苏的步骤正确，细胞仍然仍然可以生长，细胞活性损失也不是太大。

细胞复苏的步骤是：
一、准备一个1,000ml的烧杯,放入大概三分之二的37℃的温水。

二、从液氮中取出冻存管，迅速放入温水中震荡，尽可能在短时间内使其中的物质融化。

三、将冻存管中的细胞悬液转移到离心管中，然后在1,000转/分钟离心10分钟，弃去上清液。

四、在细胞培养瓶中加入培养液，然后把细胞放入培养瓶中，放入37℃温箱中培养。

经过以上步骤,如果没有
什么特殊情况细胞是可以生长的。

可以参考有关细胞培养技术方面的书籍，里面有很多的经典方法．我个人的经验是冻存时细胞密度大概要求５x１０６／ml以上,如果细胞冻存时间只要求半年到一年而已，我建议你用-８０度的冰箱即可，以免时不时需补充氮气．另细胞复苏时一般书籍推荐用37℃的水浴箱，我用的大概是４０℃，因为打开盖子时温度即降，此时能使冻存细胞更好的在半分钟至一分中内解冻。

将含冻存液的细胞移至离心管，加入４倍的培养基，５００转/分钟离心10分钟，弃上清。

用培养基调细胞密度，接种至培养瓶或所需的培养板中培养．
关于细胞冻存
(1)最好选择对数生长期的细胞用于冻存,在冻存前一天换一次培养液.
(2)用胰蛋白酶消化贴壁生长的细胞,离心并计数,去除胰蛋白酶及培养液,加入配制好的冻存液(10%DMSO或甘油),冻存液中细胞的终密度为5x106／ml-5x107／ml,封好冻存管.
(3)标准的冻存程序是降温速率-1__-2℃/分钟;当温度降到-25℃以下时,可增至
-5__-10℃/分钟;到-100℃时,可迅速浸入液氮中.要适当掌握降温的速度,总之,在开始降温时速度应小于-10℃/分钟.
细胞在液氮中储存时间理论上是无限的,,但很多未被冻存过的细胞在首次冻存后要在短期内复苏一次,观察细胞堆冻存的适应性.
这是我的复苏和冻存方法，效果不错，试一试吧。

一、复苏
1、从-196℃液氮罐中取出冻存管；
2、置37℃水浴快速复温，复温过程中轻轻摇动冻存管；
3、将细胞悬液分别移至两个10ml离心管中，添加培养基（含血清），至总体积10ml；
4、800转/min，离心10min，弃上清；
5、每管加入培养液5ml，用吸管吹打均匀，分装至4个25ml培养瓶中，37℃5%CO2条件下培养。

二、冻存
1、冷冻前一日前更换半量培养基，观察细胞生长情形。

2、配制冷冻保存溶液：将甘油加入新鲜培养基中，最后浓度为10％，混合均匀，置于室温下待用。

3、细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液计数细胞浓度为2×106 cells/ml；
4、离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为2×106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1 ml/vial。

5、冷冻保存方法：冷冻管置于4℃4hours→ -20℃2hours→ -80℃16～18 小时（或过夜）→液氮槽vapor phase 长期储存。

还要注意，复苏的细胞在第1－2周的生长可能不是特别好，最好每天换液，细胞有50－60％融合时就可以传代，以后生长就比较好了。

鼠尾胶原（collegen）：常用的包被培养皿的基质。

1。

75％酒精浸泡大鼠尾巴30min；
2。

将尾巴剪开、去掉皮毛，并剪成小段，抽出银色的尾键；
3。

把剪碎的尾键置于150ml，0.1％消过毒的醋酸中，4℃放置，并不时振荡；
4。

48h后取上清，4000转离心30min后，取上清；
分装上清（鼠尾胶）4度保存。

有时可继续向4。

中沉淀中加入10－20ml醋酸，重复以上步骤，以制备更多的鼠尾胶。

由于胶原液不能过滤也不能高压灭菌，
所心制取胶原过程当中注意无菌操作。

在使用时待凝胶后，
放在紫外线下照射过夜，第二天便可使用。

Percoll溶液的制备操作方法及注意事项
1.不同浓度(密度: 先用9份Percoll与1份8.5％NaCl或1.5MPBS混合达到生理性渗透压，然后用生理溶液(0.85％NaCl或0.15M PBS)稀释到所需浓度。

Percoll浓度(％)706050403020
比重g／ml 1.090 1.077 1.067 1.056 1.043 1.031
2.不连续密度梯度Percoll层的制备: 先将试管壁用牛血清湿润，除去多余血清，这种预处理可使逐层叠加的Percoll液平稳沿管壁流下，使形成满意的界面。

在制备过程中一般用长针头注射器从高密度向低密度逐层放置，有时相邻两层Percoll比重相差不大时，可将Percoll液放入注射器中，小针头斜面紧贴管壁，任其自然慢慢流下。

3.装样：样品体积和细胞浓度根据不同细胞而异，一般加样体积不宜过大，细胞浓度也不可过高，否则会影响细胞的分离和回收。

4.离心：一般采用离心力为400g，时间20～25min。

由于多层Percoll之间密度差别不大，因此离心机加速、降速时要慢，要平稳。

5.取样：当所要分离的细胞绝大部分在两层的界面时，可逐层去除Percoll液后收集界面部位的细胞;有时大部分细胞位于Percoll层中,则需要逐层收集。

收获含有Percoll液的细胞经2次洗涤后可供培养或检测用。

细胞培养板应该如何消毒
我们实验室里细胞板也是重复利用的。

步骤如下：用过的板子用洗洁精泡洗，然后洗净后泡酸液过夜，流水冲洗10次以上，超纯水洗3次，晾干后泡75％酒精6小时以上，放在超净台里开紫外、风机吹干再使用。

结晶紫的配制
首先,:含1%结晶紫的无水乙醇,过滤,除去杂质;
染色方法:用PBS缓冲液洗细胞1-2次,吸尽残余的液体.加入甲醇固定20分钟,弃固定液,晾干,加入结晶紫染液,染色10-20分钟,弃染色液,用水冲洗干净即可
分离单个核细胞实验操作步骤
顺便给你分离单个核细胞实验操作步骤（摘自我的毕业论文）
1.无菌静脉穿刺采血，肝素抗凝（20 u/ml全血），并加等量生理盐水稀释。

2.在15 ml离心管中加入4 ml淋巴细胞分离液（室温），吸取6 ml经稀释的抗凝血，小心滴加到分离液液面上。

（此步小心操作，勿将血液与分离液混合。

）
3.室温下离心，2000 rpm，15 min，离心后液体分4层，从上至下分别为：血浆层、单个核细胞层、淋巴细胞分离液层、红细胞及多形核细胞层。

（附图）
4.用吸管小心吸取中间混浊悬浮颗粒层（hPBMC层），转到新的离心管内，每管最多加5 ml细胞悬液，补加PBS至10 ml，吹匀。

5.离心，2000 rpm，10 min，弃上清，再次加10 ml PBS洗涤沉淀。

离心，1500 rpm，6 min，弃上清。

6.每支离心管加3 ml RPMI 1640培养液（含10%胎牛血清、100 u/ml青霉素、100 u/ml链霉素），吹匀制成细胞悬液。

7.取90 μl细胞悬浮液与10 μl 0.4%台盼蓝溶液加入1.5 ml EP管中，混匀。

8.立即取10 μl混合液从血球计数板计数池上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100倍倒置显微镜下观察计数，活细胞不染色，死细胞则为蓝色。

多聚赖氨酸的配制：
1．配制硼酸缓冲液（PH8.4）
A液：硼砂溶液－－1.907g溶于100ml三蒸水（0.05M）
B液：硼酸溶液－－1.237g溶于100ml三蒸水（0.2M）
4.5mlA液＋
5.5mlB液＝硼酸缓冲液（PH8.4）
2. 多聚赖氨酸5mg溶于50ml硼酸缓冲液中，配成100μg/ml的多聚赖氨酸溶液。

过滤除菌，－20度保存。

3. 使用时4倍稀释，可以重复使用3次！
支原体污染直接培养法
·原理：直接培养支原体于培养基中，观察其生长及菌落生成。

·特点：是目前最直接与灵敏之步骤，亦是用来评估其它侦测新步骤之标准步骤。

·缺点：培养时间长，须3－5星期才能判断。

有些支原体不能在培养基培养出来(例如M. hyorhinis)。

需同时培养支原体株作为正反应对照组，可能会造成污染。

·材枓：dextrose、L-arginine HCl、Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1) horse serum、15% yeast extract solution (autoclaved)、Bacto agar、无菌有盖螺旋试管(autoclaved)、无菌培养皿﹙60x15mm﹚、L-玻棒、37℃培养箱、厌氧缸（厌氧缸长期培养易有污染，所以厌氧包应用无菌水，每次打开厌氧缸后，用70% ethanol擦拭内壁。

）·培养基制备：基本配方为Difco PPLO broth(60%), 马血清(20%), 15% yeast extreat solution (10%), 10x stock solution (10%)。

由于培养时间长，可加入penicillin(50u/ml)至10x stock solution或加入thallium acetate (1：2000)至培养基中以防止其它细菌污染。

· 10x stock solution (1 liter) ：称取50 g dextrose，10 g L-arginine HCl，溶于1 liter蒸馏水中。

以0.22μm 无菌过滤膜过滤灭菌。

分装100 ml至瓶中，保存于-70℃。

·液体培养基(1 liter) ：称取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red 于600ml蒸馏水中，加热搅拌溶解之。

灭菌121℃，15分钟。

待温度降低至室温后，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml之15% yeast extract solution，及100ml解涷之10x stock solution，混合均匀后，分装至已灭菌之有盖螺旋试管中，10ml/管。

保存于4℃，期限1个月。

·固体培养基(1 liter )：称取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red，15g Bacto agar于600ml蒸馏水中，加热溶解之。

灭菌121℃，15分钟。

放在50℃水中浴中，待温度降低至50℃时，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml之15% yeast extract solution 及100ml解冻之10x stock solution，混合均匀后，倒入60x50㎜之无菌培养皿中，5ml/培养皿。

保存于4℃，期限1个月。

步骤：
·取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液，接种于液体培养基中，置于37℃培养二周，观察是否有混浊或是pH值改变之情形。

培养一周及二周后，分别取0.1 ml液体培养液涂在agar plate上，将其倒放置于37℃厌氧箱培养，培养至少3星期，持续观察是否有支原体之菌落出现。

·另取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液，涂抹在agar plate上，37℃厌氧培养3星期，持续观察是否支原体菌落出现。

·另作正负反应对照组，正反应对照组为Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206) 与M. arginini (ATCC 23838)。

负反应对照组为待测细胞之新鲜培养基。

结果判读：
·支原体生长较慢，所以先在液体培养基培养1~2周增殖后，再培养于agar plate上。

需至少培养3星期后，才可断定是否有支原体污染。

所以整个测试需5个星期才知正确结果。

·典型之支原体菌落类似荷包蛋(fried- egg like)，乃是由于支原体往agar下层生长所致，为圆形无色透明菌落，大小约10-55μm。

但是并非所有的支原体皆为似荷包蛋菌落，有些是圆形菌落或是类似粘菌类形态（slime）。

·若要区分细胞或是气泡造成的类似菌落，可将其自agar plate上切下，重新培养于液体培养基中，培养一星期后再种入agar plate，若是细胞则不会生长。

细胞爬片HE染色
要点：标本的制备：细胞爬片的制作很关键，首先是细胞能够爬好，细胞分布均匀，密度适中；其次是不会在染色过程中脱片，细胞形态走形！相应的处理----要选择状态良好的细胞，一般要选择消化吹打均匀传代第二或三天的细胞，镜下的标准为细胞平铺为瓶底的80％左右为宜。

细胞分布均匀，形态良好，吸取（标准是吸取而不是倾倒）培养基，加无血清培养基或PBS洗一遍，加1ml胰酶（大号瓶可加致2ml），轻晃使胰酶分布到每个角落，考虑胰酶刚刚融化，加后可在火上过几下，因为在37度消化作用最好。

一般消化2到3分钟（不同细胞不一样，），镜下（金标准）见细胞回缩，边缘折光性改变，向圆形改变（经验：这时稍用力摇晃，镜下见一些圆形细胞随胰酶漂移即可），即倒掉胰酶，加培养基或血清（体会：加培养基即可，而且吹打时不易形成泡沫）吹打，感觉象流沙一样最好，但绝对不可消化过头！！消化后要多吹打几次，尽量形成单细胞悬液，离心后调整细胞接种密度（摸索本细胞系体会：2～5×104/ml合适）。

玻片的制备：盖玻片泡清洁液24小时，自来水洗10遍，1蒸洗3遍，煮沸20分钟，2蒸洗3遍，煮沸20分钟；放入80％（须进一步明确）酒精2～4个小时，用绸布搽拭凉干。

放入瓶皿高压灭菌待用。

（本实验未用多聚赖氨酸涂片，具体过程可见DXY）
加细胞时，先在每个孔里滴几滴培养基，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。

接种后6小时细胞即可贴壁，可去上清加含药培养基，等作用时间到，取玻片。

固定：细胞爬片后用4％的多聚甲醛固定20分钟后，PBS洗2遍后进行染色；
染色：玻片用中性树胶把无细胞面和载玻片固定，便于染色。

过程（此过程适合细胞爬片，石蜡切片等不尽相同，须查相关文献和专著）——苏木素中1～1.5分钟；自来水洗数遍，加氨水（少量，起泛蓝的作用）；放入分化液（配方为盐酸酒精，比例未记！作用时间，有文献介绍2～7秒，具体须自己摸索；作用是溶解蓝色的苏木素，尤其是胞浆的蓝色）片刻；放入伊红1～2分钟；80％酒精2～3分钟；95％酒精Ⅰ2～3分钟；95％酒精Ⅱ5分钟；100％酒精Ⅰ5分钟；100％酒精Ⅱ10分钟；二甲苯Ⅰ10分钟；二甲苯Ⅱ10分钟；将玻片细胞面和载玻片用中性树胶封片。

1．用品：
⑴固定液：常用95%酒精
⑵苏木精染液：称取苏木精粉0.5g和铵矾24g溶解于70ml蒸馏水中，然后取NaIO3 1g ,水5g ，再加入甘油30ml和冰醋酸2ml，混合均匀，滤纸过滤，备用。

⑶伊红染液：称取0.5g水溶性伊红染料，溶于100ml蒸馏水中。

⑷稀盐酸酒精溶液：用75%酒精配制1%的盐酸。

⑸浓氨水溶液：在400ml自来水中滴2滴浓氨水。

⑹梯度浓度的酒精：70%，80%，90%，95%×2，100%
⑺含盖玻片的培养瓶
2．步骤：
⑴取待染细胞，用胰蛋白酶消化制成细胞悬液，调整细胞密度约为1×105/ml，接种于含盖玻片的培养瓶中，放入CO2箱中培养一段时间（时间视具体情况而定），待细胞基本长成单层，取出长有细胞的盖玻片，用PB S洗3次。

⑵将盖玻片浸入95%酒精固定15min。

⑶PBS洗2次，每次1min
⑷浸入苏木精染液，染色5-10min
⑸自来水浸洗
⑹浸入稀盐酸酒精溶液进行分色，数秒钟即可。

⑺自来水冲洗
⑻浸入浓氨水中，使胞核蓝化，3-5min
⑼自来水冲洗
⑽浸入伊红染液，染色5-10min
⑾自来水浸洗
⑿经70%，80%，90%各一次，95%酒精2次和100%酒精3次逐级脱水，每次1min
⒀通过二甲苯3次，每次1 min
⒁在载玻片上滴加中型树胶，将有细胞的一面的盖玻片向下封固于载玻片上。

3．结果：细胞质粉红色，细胞核蓝色。

细胞计数及活力测定
一、原理
培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。

计数结果以每毫升细胞数表示。

细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。

在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。

复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。

用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。

利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。

二、仪器、用品与试剂
1、仪器与用品：普通显微镜、血球计数板、试管、吸管、酶标仪（或分光光度计）
2、试剂：0.4％台盼兰，0.5％四甲基偶氮唑盐（MTT）、酸化异丙醇
3、材料：细胞悬液
三、操作步骤
（一）细胞计数
1、将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。

2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。

3、静置3分钟。

4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。

然后按下式计算：
细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×10000
注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。

（二）细胞活力
1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中。

2、加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟。

3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。

4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。

死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。

活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。

（三）MTT法测细胞相对数和相对活力
活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使MTT分解产生兰色结晶状甲赞颗粒积于细胞内和细胞周围。

其量与细胞数
呈正比，也与细胞活力呈正比。

l、细胞悬液以1000rpm离心10分钟，弃上清液。

2、沉淀加入0.5－1ml MTT，吹打成悬液。

3、37℃下保温2小时。

4、加入4—5 ml酸化异丙醇（定容）。

打匀。

5、1000 rpm离心，取上清液酶标仪或分光光度计570nm比色，酸化异丙醇调零点。

注意：MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。

附：1、0.4%台盼兰染液配制：
台盼兰0.4克加双蒸水至100 ml。

2、MTT配制：
MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液或无酚红的基础液中。

4℃下保存。

3、酸化异丙醇配制：
异丙醇中加入HCl使最终达0.04mol/L
细胞周期的测定
一、原理
细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。

从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期。

细胞周期反应了细胞增殖速度。

单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法，但它不能代表细胞群体的周期，故现多采用其他方法测群体周期。

测定细胞周期的方法很多，有同位素标记法、细胞计数法等，这里介绍一种利用BrdU渗入测定细胞周期的方法。

BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）加入培养基后，可做为细胞DNA复制的原料，经过两个细胞周期后，细胞中两条单链均含BrdU的DNA将占l/2，反映在染色体上应表现为一条单体浅染。

如经历了三个周期，则染色体中约一半为两条单体均浅染，另一半为一深一浅。

细胞如果仅经历了一个周期，则两条单体均深染。

计分裂相中各期比例，就可算出细胞周期的值。

二、仪器、用品与试剂
1、仪器、用品：同常规细胞培养
2、试剂：BrdU（1.0mg/ml），甲醇、冰醋酸，Giemsa染液，秋水仙素，2×SSC液
三、操作步骤
1、细胞生长至指数期时，向培养液中加入BrdU，使最终浓度为10μg/ml。

2、44小时加秋水仙素，使每ml中含0.1μg。

3、48小时后常规消化细胞至离心管中，注意培养上清的漂浮细胞也要收集到离心管中。

4、常规染色体制片（见第三部分：染色体技术）。

5、染色体玻片置56℃水浴锅盖上，铺上2×SSC 液，距紫外灯管6cm处紫外照射30分钟。

6、弃去2×SSC液，流水冲洗。

7、Giemsa液染色10分钟，流水冲洗，晾干。

8、镜检100个分裂相，计第一、二、三、四细胞期分裂指数。

9、计算：
细胞周期（Tc）=48/{（M1+2M2+3M3+4M4）/100}（小时）
附：（1）BrdU配制: BrdU 10mg十双蒸水10ml 4℃下避光保存。

（2）2×SSC配制: NaCl 1.75克，柠檬酸三钠·2H2O 0.88克，加水至100ml，4℃保存。

基因组DNA提取方法
About 50-100 mg (1 cm2) of young field or greenhouse-grown plant leaves, filtered and dried mycelium, the muscle of one back leg of a grasshopper and shrimp muscle were used for DNA extraction. The fresh tissue was homogenized in 400 µl of sterile salt homogenizing buffer (0.4 M NaCl 10 mM Tris-HCl pH 8.0 and 2 mM
EDTA pH 8.0), using a Polytron Tissue Homogenizer, for 10-15 s. Then 40 µl of 20% SDS (2% final concentration) and 8 µl of 20 mg/ml protenase K (400 µg/ml final concentration) were added and mixed well. The samples were incubated at 55-65°C for at least 1 h or overnight, after which 300 µl of 6 M NaCl (NaCl saturated H2O) was added to each sample. Samples were vortexed for 30 s at maximum speed, and tubes spun down for 30 min at 10 000 g. The supernatant was transferred to fresh tubes. An equal volume of isopropanol was added to each sample, mixed well, and samples were incubated at -20°C for 1 h. Samples were then centrifuged for 20 min, 4°C, at 10 000 g. The pellet was washed with 70% ethanol, dried and finally resuspended in 300-500 µl sterile dH2O.
The purity of the DNA, determined from the A260/A280 ratio averaged >1.77 for all organisms. There was no RNA contamination in all samples nor any sign of degraded DNA during preparation (Fig. 1 ). The yield of DNA ranged from 500 to 800 ng/mg fresh weight for all individuals sampled. The amount of tissue required for this method is minimal, but we scaled up the amount of tissue 10-fold without any reduction in DNA quality and quantity. The average number of PCR reactions that can be performed using DNA extracted from 50 mg tissue was >3000.
Universal and rapid salt-extraction of high quality genomic DNA for PCR- based techniques
Nucleic Acids Res. 1997 25: 4692-4693
本人欲提取所培养贴壁细胞的基因组DNA，作为PCR模板，结合所查阅的资料及经费情况，自己综合了一种DNA的提取方法。

不知可行否，列出来请各位朋友指正。

1，贴壁细胞用胰酶消化，离心收集。

2，细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次，离心收集。

3，重复2。

4，加入5ml DNA提取缓冲液，(10m mol/L Tris-cl, 0.1 mol/L EDTA, o.5% SDS),混匀。

5，加入25ul 蛋白酶K ,使终浓度达到100ug/ml, 混匀，50℃水浴3h,
6，用等体积的酚抽提一次，2500r/min 离心收集水相，
用等体积的（酚，氯仿，异戊醇）混合物抽提一次，2500r/min 离心收集水相。

用等体积的氯仿，异戊醇抽提一次。

7，加入等体积的5mol/L 的LiCL,混匀，冰浴，10min.
8， 2500r/min,离心10min. 转上清与一离心管中。

加入等体积的异丙醇。

室温10分钟。

9， 2500r/min,离心10min。

弃上清。

加入0.1倍体积3mol/L 乙酸钠(PH5.2)与2倍体积-20℃预冷无水乙醇。

-20℃20分钟。

10， 12000r/min, 室温离心5分钟。

弃上清。

将DNA溶于适量TE中。

精子DNA快速提取
在<基因治疗的原理与实践>中找到了。

我没做过，试试看。

主要分为两步：
１。

分离精子
1).新鲜精液：离心1500转／分１０分钟分离精子
如果棉拭子从衣物口腔或其他物品中采集的精液，用SMB溶液浸泡。

离心保存。

SMB: PH:7.2
10mM Tris-HCL
10mM EDTA
50mM NaCl
2% SDS
2).用SMB溶液清洗精子3次，保存
2. 提取DNA
1).酶消化法：用含有40mM DTT, 0.3mg/ml 蛋白酶K的SMB溶液0.5ml稀释精子。

56Ｃ消化1h，然后酚氯法提取
2).超声波法：精子稀释于0.5mlSMB,加入0.2mlＴＥ,超声粉碎精子，释放DNA，然后酚氯法提取
如你所述，精子的致密结构是提取的瓶颈，我想关键是致密结构的破坏，物理的方法不必说，化学的方法，我想提高SDS和蛋白酶K浓度是否可以有帮助。

我曾用过反复液氮－沸水浴方法攻克难以消化的组织标本，也可意识试，
Feulgen染色
Feulgen染色的原理是在60度条件下DNA分子中的嘌呤碱和脱氧核糖的连键可被1mol/l盐酸水解打开，游离出的脱氧核糖醛基能与schiff试剂结合，形成紫红色的复合物，RNA不受影响，具有DNA特色。

细胞核为紫红色或分红色，胞质无色。

与前两者相比，相对麻烦，大多数实验室都有配制好的液体，较为方便。

常用染料性能简介
（一）天然染料
1、苏木精苏木精是从南美的苏木（热带豆科植物）干枝中用乙醚浸制出来的一种色素，是最常用的染料之一。

苏木精不能直接染色，必须暴露在通气的地方，使他变成氧化苏木精（又叫苏木素）后才能使用，这叫做“成熟”。

苏木精的“成熟”过程需时较长，配置后时间愈久，染色力愈强。

被染材料必须经金属盐作媒剂作用后才有着色力。

所以在配制苏木精染剂时都要用媒染剂。

常用的媒染剂有硫酸铝按、钾明矾和铁明矾等。

苏木精是淡黄色到锈紫色的结晶体，易溶于酒精，微溶于水和甘油，是染细胞核的优良材料，他能把细胞中不同的结构分化出各种不同的颜色。

分化时组织所染的颜色因处理的情况而异，用酸性溶液（如盐酸—酒精）分化后呈红色，水洗后仍恢复青蓝色，用碱性溶液（如氨水）分化后呈蓝色，水洗后呈蓝黑色。

2、洋红洋红又叫胭脂红或卡红。

一种热带产的雌性胭脂虫干燥后，磨成粉末，提取出虫红，再用明矾处理，除去其中杂质，就制成洋红。

单纯的洋红不能染色，要经酸性或碱性溶液溶解后才能染色。

常用的酸性溶液有冰醋酸或苦味酸，碱性溶液有氨水、硼砂等。

洋红使细胞核的优良染料，染色的标本不易褪色。

用作切片或组织块染都适宜，尤其适宜于小型材料的整体染色。

用洋红配成的溶液染色后能保持几年。

洋红溶液出现浑浊时要过滤后再用。

（二）人工染料
人工染料，即苯胺染料或煤焦油染料，种类很多，应用极广。

它的缺点是经日光照射容易褪色，苯胺蓝、亮绿、甲基绿等更易褪色。

在制片中注意掌握酸碱度，并避免日光直射，也能经几年不褪色。

1、酸性品红酸性品红是酸性染料，呈红色粉末状，能容于水，略溶于酒精（0.3%）。

他是良好的细胞制染色剂，在动物制片上应用很广，在植物制片上用来染皮层、髓部等薄壁细胞和纤维素壁。

他跟甲基绿同染，能显示线粒体。

组织切片在染色前先浸在带酸性的水中，可增强它的染色力。

酸性品红容易跟碱起作用，所以染色过度，易在自来水中褪色。

2、刚果红刚果红是酸性染料，呈枣红色粉末状，能溶于水喝酒精，遇酸呈蓝色。

他能作染料，也用作指示剂。

他在植物制片中常作为苏木精或其他细胞染料的衬垫剂。

他用来染细胞质时，能把胶制或纤维素染成红色。

在动物组织制片中用来染神经轴、弹性纤维、胚胎材料等。

刚果红可以跟苏木静作二重染色，也可用作类淀粉染色，由于他能溶于水和酒精，所以洗涤和脱水处理要迅速。

3、甲基蓝甲基蓝是弱酸性染料，能溶于水和酒精。

甲基蓝在动植物的制片技术方面应用极广。

他跟伊红合用能染神经细胞，也是细菌制片中不可缺少的染料。

它的水溶液是原生动物的活体染色剂。

甲基蓝极易氧化，因此用他染色后不能长久保存。

4、固绿固绿是酸性染料，能溶于水（溶解度为4%）和酒精（溶解度为9%）。

固绿是一种染含有浆质的纤。