响应面法优化泥蚶多糖的提取工艺

响应面法优化泥蚶多糖的提取工艺
孔福旺;姜玉新;湛孝东;唐小牛
【摘要】[Objective] The aim was to use response surface methodology to determine optimum conditions for extraction of polysaccharides from Tegillarca granosa. [ Method] Response surface methodology with three-factors and three-levels was carried out for optimizing the extraction process of polysaccharides from Tegillarca granosa. A central composite design including independent variables, such as extraction temperature (A) , extraction time (B) , and ethanol concentration (C) were obtained through Box-Benhnken central combination design. Selected response which evaluates the extraction process was polysaccharide yield. [ Result ] The independent variable with the largest effect on response was ethanol concentration (C). The optimum extraction conditions were found to be extraction temperature 69.6 °C, extraction time 6. 2 h, and ethanol concentration of 78% ( v/v) , respectively. Under these conditions, die extraction efficiency of polysaccharide can increase to 1.635%. [Conclusion] Study on the extraction of polysaccharides from Tegillarca granosa could provide a certain theoretical direction for extracting polysaccharides from Tegillarca granosa on a large scale.%[目的]利用响应面分析法优化泥蚶多糖的提取工艺.[方法]根据中心组合(Box-Benhnken)试验设计原理,以提取温度、提取时间、乙醇浓度3个因素为自变量,多糖得率为响应值,设计了3因素3水平响应面分析试验,以优化泥蚶多糖提取的工艺条件.[结果]乙醇浓度是对响应值影响最大的因素,泥蚶多糖提取的最佳工艺条件为提取温度69.6℃,提取时间6.2h,乙醇浓度78％,
在此条件下,泥蚶多糖的提取率为1.635％.[结论]研究优化了泥蚶多糖的提取工艺,
为大规模制备泥蚶多糖提供参考.
【期刊名称】《安徽农业科学》
【年(卷),期】2012(040)033
【总页数】3页(P16347-16349)
【关键词】泥蚶;多糖;提取;响应面
【作者】孔福旺;姜玉新;湛孝东;唐小牛
【作者单位】皖南医学院寄生虫学教研室,安徽芜湖241002;皖南医学院寄生虫学
教研室,安徽芜湖241002;皖南医学院寄生虫学教研室,安徽芜湖241002;皖南医学
院寄生虫学教研室,安徽芜湖241002
【正文语种】中文
【中图分类】S944.4+4
泥蚶属软体动物门双壳纲列齿目蚶科蚶属，又称血蚶(蛤)。

《本草纲目》记载，血蛤(蚶)“味甘性温，功能除了补血外，还可以润五脏、健胃、清热化痰、治酸止痛，主治痰热咳嗽、胸胁疼痛、痰中带血等”。

贝类多糖是存在于贝类体内的一种生物活性物质，能激活机体的非特异性免疫和特异性免疫系统，从而增强机体的免疫功能。

文蛤多糖对环磷酰胺(CTX)造成的小鼠免疫功能损伤有对抗作用，能使免疫器官胸腺、脾脏增重，外周血液白细胞数量增加，吞噬能力增强，血清溶血素抗体水平增高［1］。

河蚌多糖能显著增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力［2］，但关于
泥蚶多糖的提取工艺及功能研究尚未见报道。

笔者拟选取泥蚶为研究对象，利用响
应面法优化泥蚶多糖的提取工艺以获得多糖最大产出率，并选取提取温度、提取时间、乙醇浓度作为考察因素，以期为泥蚶多糖的生物功能研究提供参考。

1 材料与方法
1.1 材料研究对象:泥蚶产于浙江舟山。

主要试剂:95%乙醇、无水乙醇、甲醇、氯仿、丙酮、氢氧化钠、活性炭、正丁醇、苯酚、葡萄糖，均为国产分析纯;经济型透析袋(MWCO:14000Dalton)购于生工生物工程(上海)有限公司。

主要仪器:DS-1高速组织捣碎机，上海标本模型厂;HH-2数显恒温水浴锅、85-2A恒温磁力搅拌器，国华电器有限公司;JY96-Ⅱ超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司;Avanti J-26XP高速冷冻离心机，BECKMAN Coulter公司;U-2800 UV-Vis分光光度计，HITACHI公司;FD-1冷冻干燥机，北京德天佑科技发展有限公司。

1.2 方法
1.2.1 泥蚶多糖的提取。

新鲜泥蚶，去壳干燥称重，加蒸馏水1∶1(W/V)高速匀浆10 min，制备匀浆液，5 000 r/min离心10 min取沉淀。

加5%甲醇浸泡24 h 脱脂后，5 000 r/min离心10 min，弃上清，重复脱脂2次。

沉淀干燥后加蒸馏水1∶20(W/V)，制备泥蚶提取液，用0.1 mol/L NaOH调 pH 为8.0，再将其超声粉碎(100 W)40 min。

按照试验设计的不同条件，将提取液等量分为17份分别在50～70℃下水浴4～8 h并不断搅拌，加压过滤后，向滤液中加入95%乙醇至乙醇最终浓度为60% ～80%，4℃静置24 h。

将白色絮状沉淀8 000 r/min离心10 min，取沉淀复溶，5 000 r/min离心，取上清。

加入等体积同浓度乙醇再次沉淀多糖，如此反复5次。

依次用无水乙醇、丙酮淋洗后，加适量水复溶，冷冻干燥。

再加适量水复溶，用Sevag法去蛋白，活性炭脱色，透析法除离子后，冷冻干燥，即得到泥蚶多糖。

1.2.2 泥蚶多糖的含量测定［3］及多糖得率计算。

1.2.2.1 标准曲线绘制。

精密称取105℃下干燥至恒重的葡萄糖50 mg，置100
ml容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得葡萄糖标准溶液。

精密吸
取葡萄糖标准溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 和3.0 ml分别置于50 ml容量瓶中，加蒸馏水定容，即得葡萄糖标准液浓度分别为5、10、15、20、25、30 μg/ml。

精密吸取上述溶液各2.0 ml，置具塞试管中，然后分别加入5%苯酚1.0 ml，再
加入浓硫酸5.0 ml，摇匀后，沸水浴加热15 min后冷却到室温。

以2.0 ml蒸馏
水按同样显色操作为空白，在波长490 nm处测定吸光度A。

以葡萄糖标准溶液
浓度C为横坐标，A值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.2.2 多糖含量测定及得率计算。

准确称取泥蚶粗多糖10 mg，加蒸馏水稀释至一定倍数(D)后摇匀，精密吸取2.0 ml，测吸光度(A)值，根据标准曲线方程，算出多糖浓度(M)，计算多糖含量。

计算公式:
式中，W为各条件所得多糖质量(g);Q为样本质量(g)。

2 结果与分析
2.1 拟合模型响应面法用来优化泥蚶多糖的提取工艺，确定3个自变量的最佳组合。

自变量的选取和范围设定均参考相关文献［4－5］。

根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理，以多糖得率为响应变量，提取温度、提取时间、乙醇浓度为自变量，每个自变量被编码为3个水平:－1、0、1.0具体响应面试验各因素水
平编码见表1。

表1 响应面分析各因素水平编码水平因素提取温度(A)∥℃ 提取时间(B)∥h 乙醇浓度(C)∥%－1 50 4 60 0 70 6 70 1 90 8 80
2.2 响应面试验结果及建立模型方程与显著性检验响应面试验结果见表2。

通过对表2所得数据进行回归分析，各因素经回归拟合后，得出回归方
程:Y=1.57+0.015A+0.005B+0.22C －0.01AB －0.02AC －0.005BC －0.026A2－0.006 5B2 －0.15C2。

表2 响应面分析方案及试验结果?
回归方程中各变量对指标(响应值)影响的显著性，由F检验来判定，概率P(F＞Fα)的值越小，则相应变量的显著程度越高。

试验得出，F模型 =296.35，FA=9.84，FB=1.09，FC=2 117.5，FAB=2.19，FAC=8.75，FBC=0.55，FA2=16.17，FB2=0.97，FC2=494.2;P模型＜0.000 1，PA=0.016 4，PB=0.330 4，PC ＜0.000 1，PAB=0.182 7，PAC=0.021 2，PBC=0.483 7，PA2=0.005 1，
PB2=0.356 8，PC2＜0.000 1。

由此可以看出，各因素中一次项A是显著的(P＜0.05)，C是极显著的(P＜0.01)，二次项 A、C是极显著的，其次是交互项 AC、AB、BC均是不显著的。

由此可见，各具体试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系。

回归方程是极显著的，相关系数R2=0.997 4，说明响应值(多糖得率)的变化有99.74%来源于所选变量，即提取温度、提取时间和乙醇浓度。

因此，回归方程可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系，可利用该回归方程确定最佳提取工艺条件。

2.3 响应曲面分析根据回归方程，作出响应面，考察拟合响应面的形状，分析提取温度、提取时间、乙醇浓度对泥蚶多糖提取率的影响，见图1～3。

各因素及其相互作用对响应值的影响可以通过各图直观反映出来。

由图1～3可知，并不是所有因素对泥蚶多糖的提取都有显著的影响，乙醇浓度的影响最为显著，随加乙醇浓度的升高，多糖得率随之增大，表现为曲面较陡;提取温度的影响次之，表现为曲面较平缓且随其数值的增加或减少，响应值变化较小;提取时间影响最小，曲面最为平缓。

各具体试验因素对响应值的影响大小是不同的，主次因素顺序为乙醇浓度＞提取温度＞提取时间。

图1 提取温度和提取时间对多糖得率影响的响应曲面
图2 提取温度和乙醇浓度对多糖得率影响的响应曲面
2.4 最优条件确定对回归方程取一阶偏导数，并令其等于零，可以得到曲面的最
大点，即得到提取的最佳条件:提取温度69.56 ℃，提取时间 6.23 h，乙醇浓度77.51%，预测泥蚶多糖得率为1.65%。

为方便实际操作，将泥蚶多糖的最佳提取条件修正为提取温度69.6℃，提取时间6.2 h，乙醇浓度78%。

提取2次得多糖
得率为1.635%，实际测定值比理论预测值低0.85%，说明该模型适用于泥蚶多糖提取工艺的优化。

图3 提取时间和乙醇浓度对多糖得率影响的响应曲面
3 结论
响应面法适用于泥蚶多糖提取工艺的研究，其采用合理的试验设计对提取工艺进行全面分析和评测，并依据回归分析确定各工艺条件的影响因子，较准确地反映各因素对多糖得率提取的影响及各因素之间的交互作用。

3个因素，17个组合的泥蚶
多糖提取试验中，多糖得率最小为1.13%，最大为1.64%。

其中乙醇浓度是对多
糖得率影响最大的因素。

试验得出泥蚶多糖的最佳提取工艺条件:提取温度69.6℃，提取时间6.2 h，乙醇浓度78%，在此条件下多糖得率为1.635%，与预测值1.65%基本一致。

该研究可为后续泥蚶多糖的大规模提取及生物活性研究提供参考。

参考文献
［1］窦昌贵，黄芳，黄罗生，等.文蛤多糖抗癌免疫药理作用的研究［J］.中国海
洋药物，1999，18(2):15 －19.
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