真菌发酵酒精废弃物合成单细胞蛋白基质及菌种筛选

2018年第37卷第1期 CHEMICAL INDUSTRY AND ENGINEERING PROGRESS ·269·
化工进
展
真菌发酵酒精废弃物合成单细胞蛋白基质及菌种筛选
何秋颖，陈渊源，谢丽
（同济大学环境科学与工程学院，上海200092）
摘要：为了优选利用酒精废弃物生产单细胞蛋白（single cell protein，SCP）的最佳基质和菌种组合，从而实现其高值化利用，本文选取了黄酒加工废弃物（黄酒糟和米浆水）以及木薯酒精加工废弃物（木薯原糟和木薯酒糟上清液）4种基质作为发酵底物，并以产朊假丝酵母（Candida utilis）和白地霉（Geotrichum candidum）2种常见菌种作为筛选对象，通过摇瓶发酵实验，考察不同基质对菌种产SCP的影响，同时对比不同菌种利用酒精废弃物发酵合成SCP的能力，从而选出最优发酵基质和菌株。

结果表明，以黄酒糟和米浆水按质量分数6%配比，同时接种产朊假丝酵母和白地霉进行混菌发酵4天时，SCP的产率及产量均达最优值，干物质产率可达3.91，产量可达
90.22g/L，粗蛋白含量可达53.3%，且发酵产物中的氨基酸成分齐全，作为蛋白饲料具有良好的应用前景。

关键词：酒精废物处理；单细胞蛋白；真菌发酵；优化
中图分类号：X705 文献标志码：A 文章编号：1000–6613（2018）01–0269–07
DOI：10.16085/j.issn.1000-6613.2017-0663
Screening of substrates and strains for producing single cell protein by
fungal fermentation in distillery waste
HE Qiuying，CHEN Yuanyuan，XIE Li
（College of Environmental Science and Engineering，Tongji University，Shanghai 200092，China）Abstract: To utilize distillery residue to produce value-added products，the productions of single cell protein（single cell protein，SCP）from various substrates and strains were investigated. Yellow winery residue（yellow wine lees and rice wastewater）and cassava distillery residue（cassava stillage and its supernatant）were chosen as four kinds of fermentation substrates. Meanwhile Candida utilis and Geotrichum candidum were chosen as strains. Batch fermentation was applied to study the effect of substrates and strains on SCP production. The experimental results showed that yellow winery residue was suitable for SCP production. The maximum SCP yield was 90.22g/L with production rate of 3.91 and crude protein content of 53.3%，after 4 days of fungal fermentation via Candida utilis and Geotrichum candidum co-culture in 6% yellow wine lees-rice wastewater substrate. Furthermore，the synthesized SCP product contains essential amino acids，which could be widely used as animal feed in the future.
Key words：distillery waste treatment；single cell protein；fungal fermentation；optimization
全球每年会产生大量的有机废弃生物质，如糟渣、农业残余物、木质废弃物等，其中包含大量的糖、蛋白、纤维素等可再生资源[1]。

近年来利用真菌微生物处理高浓度有机废弃物同时生产单细胞蛋白（single cell protein，SCP）受到研究者的广泛关注[2-3]。

SCP，又称微生物蛋白或菌体蛋白，是指酵母菌、真菌、非病性细菌等单细胞生物体内所含蛋收稿日期：2017-04-16；修改稿日期：2017-05-09。

基金项目：国家自然科学基金（51378373）及中央高校基本科研业务费项目。

第一作者：何秋颖（1993—），女，硕士研究生。

E-mail：folliaho.hqy@ 。

通讯作者：谢丽，教授，研究方向为酒精废弃物的资源化利用。

E-mail：**********************.cn。

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白质[4]。

它作为一种环境友好且经济适用的蛋白质来源，可以用作动物饲料，缓解蛋白市场压力。

我国糟渣资源丰富，仅酿造酒精、淀粉、糖类、果品加工等工业部门产生的糟渣可达6000万吨/ 年[5]。

由于某些食品工业生产的季节性，限制了传统环境生物技术的应用，因此出现了利用真菌发酵这类食品加工废弃有机生物质，转化为附加值高的优质单细胞蛋白饲料的处理新思路[6]。

此方式不仅可以去除有机污染物，减轻环境负荷，又可以回收资源，给企业带来经济效益。

NITAYA V ARDHANA 等[7]利用少孢根霉发酵糖蜜酒糟，接种72h后发酵产物蛋白含量约为50%，COD去除率为80%。

葛若梅等[8]利用酵母菌、白地霉等混菌发酵木薯酒精渣，发酵产物的粗蛋白含量可从底物的1.42%提高到23.56%。

酵母菌和霉菌是较为常用的生产SCP 的菌种，两者在发酵过程中利用底物的方式不同，因此有机废弃生物质的特性以及菌种的筛选会影响SCP合成效果[9-10]。

综上所述，本研究选用酒精生产废弃物，以木薯酒糟、黄酒加工废弃物为研究对象，分别接种酵母菌（产朊假丝酵母）和霉菌（白地霉），探究不同发酵有机基质和菌种对SCP合成过程中干物质产率以及粗蛋白含量的影响，从而筛选出最优发酵基质和接种菌株，为真菌发酵酒精废弃物合成SCP技术提供理论指导技术支撑。

1 实验材料和方法
1.1 发酵基质与菌种
发酵基质为木薯酒精废弃物（木薯原糟和木薯酒糟上清液）和黄酒废弃物（米浆水和黄酒糟），分别取自江苏某木薯酒精厂酒精蒸馏塔排出的废水、浙江省某黄酒厂浸米后所排废水和压榨后所得固体酒糟，其中木薯酒精废水上清液经室温下转速为12000r/min离心10min后获得。

所有发酵基质均储存于4℃冰箱中，以防变质。

菌种为产朊假丝酵母（Candida utilis）和白地霉（Geotrichum candidum），购于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），CGMCC菌种保藏编号分别为2.1180和2.1080。

1.2 实验装置与方法
（1）菌株活化、种子液制备及生长曲线测定将产朊假丝酵母和白地霉菌株接种至灭菌后的酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）液体培养基（蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，葡萄糖1%）中，放置28℃生化培养箱中培养3天后加入5mL丙三醇，保存于–24℃冷冻室。

取保存的产朊假丝酵母菌液以及白地霉菌液分别接入YPD固体培养基上，在28℃下培养3天。

再分别从扩大培养后的固体培养基中挑取少量菌种于YPD液体培养基中制成菌悬液，在28℃，180r/min下培养10h后，每隔2h取少量菌液通过4层无菌纱布过滤，除去菌丝，用血球计数板对滤液孢子数计数，当每毫升孢子数数量级达107时，菌液可以作为液体种子液使用。

将产朊假丝酵母和白地霉的菌悬液在28℃，180r/min的恒温摇床中振荡培养，期间每隔2h测定菌悬液的吸光度A560，并绘制生长曲线。

（2）真菌发酵有机废弃基质合成SCP 木薯原糟、木薯上清液、6%黄酒糟米浆水混合物基质经121℃高压灭菌20min后，产朊假丝酵母和白地霉种子液分别以10%体积比例接种至300mL不同基质中。

在自然pH、30℃、180r/min水浴摇床及1vvm （vvm表示单位体积培养液在单位时间内通入压缩空气量）曝气率条件下培养。

每隔24h取10mL发酵液样品，12000r/min离心10min后，上清液经0.45μm滤膜过滤，测定COD、TN等指标，固体真空冷冻干燥后粉碎测其干物质质量，并用凯氏定氮仪测其粗蛋白含量。

1.3 测试指标与分析方法
液体样品主要测定其化学需氧量（COD）、总氮（TN）、氨氮（NH4+-N）、总磷（TP）、溶解性蛋白质、总糖、总悬浮物（TSS），均参照水和废水监测分析方法（第4版）[11]。

对固体基质测定粗蛋白、粗纤维、粗淀粉、总固体（TS）、灰分。

溶解性蛋白质采用考马斯亮蓝法测定。

淀粉含量采用旋光法测定（GB/T 20194—2006）。

粗纤维含量采用过滤法测定（GB/T6434—2006）。

粗蛋白含量采用凯氏定氮法测定（GB/T6432—1994）。

氨基酸成分通过水解法测定（GB/T 18246—2000）。

干物质质量采用菌体干重法测定。

干物质产率的计算方法如下：生物质增量=每天的生物质干重–初始生物质干重，干物质产率=生物质增量与初始生物质干重的比。

2 结果与讨论
2.1 酒精生产废弃物基质特性
首先考察了木薯酒精和黄酒生产废弃物的液体基质特性，所得的实验结果如表1所示。

木薯原糟及其上清液、黄酒米浆水均呈酸性，pH为3.5～4，
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其中米浆水的SCOD 、TN 及TP 浓度最高，分别为55800mg/L 、2620mg/L 、3338mg/L 。

对比3种废液的溶解性蛋白含量，其大小关系与总氮含量的关系一致，均为米浆水＞木薯原糟＞木薯上清液。

其中米浆水的溶解性蛋白含量是木薯上清液的近80倍，高达1948mg/L 。

黄酒糟固体基质的特性如表2所示，可以看出黄酒糟固体含有高达36.3%的粗蛋白，同时纤维素含量只有约6%，能够较好地被微生物降解转化为自身生长所需的营养物质。

因此从基质特性可以初步判断，相比较木薯酒糟及其上清液而言，黄酒糟及米浆水可能更适合作为真菌发酵合成SCP 的基质。

表1 木薯原糟及其上清液、米浆水3类液体基质特性
项目
木薯原糟
木薯上清液
米浆水
pH 3.73±0.01 4.00±0.50 3.60±0.00 SCOD/mg·L
–1 34520±170 36000±210 55800±283 NH
4+
-N/mg
·L –1 4.0±0.0 3.2±0.0 296±0 TN/mg ·L –1 500±28 250±13 2620±85 TP/mg ·L –1 1238±3 1072±9 3338±3 溶解性蛋白质
/mg ·L –1
28.52±0.35 25.40±0.56 1948±7
TS/g ·L –1 50.74±0.00 — 111.22±0.00 VS/g ·L –1 43.43±0.00 — 105.15±0.00 TSS/g ·L –1 34.48±0.00 — 34.29±0.63 VSS/g ·L –1 28.13±0.02
— 32.59±0.55 表2 黄酒糟固体基质各组分质量分数 单位：%
酒精
粗蛋白
灰分
粗淀粉
粗纤维
TS VS
4.50 36.31 4.26 1
5.73
6.54 46.67 45.72 ±0.32 ±1.25 ±0.29 ±2.43 ±0.32 ±0.32 ±0.00
2.2 不同基质真菌发酵合成SCP 产率比较
菌种和基质的筛选是真菌发酵合成单细胞蛋白饲料的关键因素，干物质的产率和粗蛋白的含量均取决于菌种的性能和基质的特性。

一些食品加工废弃物中含有较高的纤维素含量，因此需要霉菌分泌纤维素降解酶将其降解为糖类，这类发酵多采用固态发酵形式[12]。

相比而言，液态发酵形式更能实现连续化，并且有利于SCP 的分离和提取，但随之成本也有所提升[13]。

因此，本研究利用有机基质的不同特性，对比液态发酵与固态发酵，并对酒精废弃物合成SCP 最优发酵基质进行了筛选。

为保证基质在同等条件下进行比较，将固态黄酒糟和米浆水按木薯原糟相同质量分数（6%）配比（以下简称黄酒糟米浆水）。

将4种基质（木薯原糟、木薯上清液、黄酒糟米浆水、固态黄酒糟）分别接
种真菌发酵4天，得到SCP 干物质产率（图1）。

由图1可知，对于单菌和混菌两种接种方式，发酵基质中的干物质产率均随发酵时间增加而递增，说明SCP 的合成速率大于基质被消耗的速率。

比较4种基质的发酵过程发现，固态黄酒糟相比液态基质在SCP 合成速度上较慢，干物质产率在发酵4天时最高仅为0.55，这是由于固态发酵基质中干物质自身质量较大，相比而言真菌发酵合成的SCP 质量增幅不明显。

对于3种液态发酵基质，在相同条件下黄酒糟米浆水混合基质相比较能够产生更多的SCP ，发酵第4天时，单独接种酵母菌和两者1∶1混菌发酵后的SCP 产率最大，分别为3.38和3.91，对应的干物质产量最大分别为87.43g/L 和90.22g/L （如图2），相比初始酒糟中干物质提高了4.4倍和
图1 4种基质单菌和混菌接种条件下干物质产率对比
图2 黄酒糟米浆水发酵合成SCP 产量和产率随发酵时间变化
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4.9倍，表明黄酒糟米浆水更适合真菌的生长及SCP
的合成。

同时，混菌发酵的干物质产量优于单菌发
酵效果，前期的研究结果如YADA V等[14]在利用克
鲁维酵母和酿酒酵母回收乳清废水蛋白的实验中，
也发现混菌发酵时的生物质产率比单菌发酵时高，
分别为0.31和0.27。

张敏[15]利用5种酵母菌株对糖
蜜酒糟进行真菌发酵研究，结果表明单菌发酵时的
最高干物质产量可达10.79g/L，而混菌发酵时的最
高生物质产量可达12.98g/L。

本文通过比较酵母和
霉菌在单菌发酵及混合发酵时的SCP产率，进一步
印证了不同类真菌间的互利共生作用。

2.3 不同基质真菌发酵合成SCP粗蛋白含量比较
对作为饲料的SCP，不仅要有一定的干物质产
量要求，蛋白质的含量也是十分重要的衡量指标。

本研究对4种发酵产物干物质中粗蛋白的含量进行
了测定和比对。

表3的数据结果表明，发酵前后干
物质中粗蛋白都有了不同程度的增加，其中增幅最
明显的是黄酒糟米浆水发酵基质，干物质中粗蛋白
含量从初始的33%左右增加到50%以上，其中混菌
（1∶1）发酵产物最高达53.3%，增幅达19.6%，
其次是单菌接种产朊假丝酵母，增幅达18.68%。

再
次是固态黄酒糟，无论是单菌还是混菌接种发酵4
天后，粗蛋白含量均能达到45%左右，尤其在混菌
（1∶1）接种后基质粗蛋白增幅达15.6%。

尽管固
态黄酒糟作为发酵基质得到的SCP产率不高，但粗
蛋白含量的提高也说明了黄酒糟含有的营养物质更
有利于产朊假丝酵母和白地霉的生长繁殖。

潘丽
娜[16]利用黄酒糟为原料接种酿酒酵母进行固态发
酵生产酵母培养物产品，得到的酵母产物中粗蛋白
表3 4种基质发酵合成单细胞蛋白粗蛋白含量对比
基质类型菌种粗蛋白含量/% 增幅
/% 0天4天
木薯原糟单菌（产朊假丝酵母）16.2±1.2 17.5±2.3 1.3
单菌（白地霉）17.5±1.3 19.3±1.1 1.8
混菌（1∶1）16.4±0.2 17.3±1.20.9 木薯上清液单菌（产朊假丝酵母）15.2±1.1 17.2±1.4 2.0
单菌（白地霉）15.4±0.5 16.2±1.00.8
混菌（1∶1）15.4±0.9 17.3±1.5 1.9 黄酒糟米浆水单菌（产朊假丝酵母）34.0±0.4 52.6±0.618.6
单菌（白地霉）33.4±0.7 47.8±0.814.4
混菌（1∶1）33.7±0.3 53.3±0.519.6黄酒糟（固态）单菌（产朊假丝酵母）29.6±0.8 44.8±0.715.2
单菌（白地霉）36.0±0.1 46.2±0.410.2
混菌（1∶1）30.8±0.3 46.3±0.215.5含量为47.99%，较原料增加了11.85%。

当黄酒糟与米浆水形成液态基质后，真菌能够同时利用黄酒糟的碳源和米浆水中的氮源，且液态基质的充分混合使营养物质更均匀，加上曝气系统给真菌提供了充足的氧气，因此黄酒糟米浆水液态发酵较黄酒糟固态发酵具有更高产的效果。

在相关的液态发酵研究中，周媛等[2]向高浓度发酵废水中接种近平滑假丝酵母和黑曲霉等工业菌种进行发酵，产物中的生物量可达8.0g/L，粗蛋白含量为50%。

PIRES等[3]利用混合酵母菌发酵稀释后的糖蜜酒糟，发酵3天后生物量可达6.17g/L，粗蛋白含量为53.3%。

而在相同发酵条件下，木薯原糟因自身含氮量较少，同时木质纤维素含量较黄酒糟多，使得酵母菌和霉菌无法起到各自的作用。

产朊假丝酵母单菌发酵效果与前期学者的实验结果相似，励飞[17]利用热带假丝酵母对木薯原糟进行液态发酵，发酵40h后干物质含量为56.8g/L，粗蛋白含量为17.8%。

因此，本研究通过4种基质组合的对比，选定将黄酒糟与米浆水的混合物作为液态真菌发酵合成SCP的最优基质。

混合液态发酵既避免了对黄酒糟进行稀释处理，又可对黄酒加工过程中产生的米浆水进行资源化利用。

同时，混菌（1∶1）发酵相比单菌发酵可得到更高产率和更高蛋白含量的发酵产物，说明产朊假丝酵母和白地霉之间能互利共生，协同发酵。

2.4 黄酒糟米浆水发酵产物SCP特性
黄酒糟米浆水发酵产物中的SCP可作为一种潜在的动物蛋白饲料。

SCP中除了具有一定的粗蛋白的含量外，更含有氨基酸等丰富的营养物质。

宏观上，真空冷冻干燥后的发酵产物外观为黄褐色，由于含有一定浓度的酒精，因此散发着黄酒的醇香，具有良好的感官性。

微观上，通过对发酵产物组成成分的分析（表4），结果表明发酵后得到的SCP 除了粗蛋白含量从初始原料中的36.6%提高至66.3%外，8种常见氨基酸含量均有一定程度的增加，其中异亮氨酸从初始1.45%增加至4.12%，均高于国家标准（GB/T 5916—2008），可见SCP富含满足动物营养需求的必须氨基酸，具有较高的营养价值。

此外，发酵产物中黄曲霉毒素B1含量仅为5μg/kg，远低于国家饲料卫生标准（GB13078—2001）中的50μg/kg，因此该发酵产物作为动物饲料具有无害性。

将发酵产物与市场上现有的几种常见动物饲料成分进行对比，其中表5为粗蛋白含量对比，图3为氨基酸含量对比。

从表5中得知，通过在黄酒
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表4 黄酒糟米浆水发酵产物指标检测结果
项目 黄酒糟原料 发酵产物 国家标准
（GB/T 5916—2008）
粗蛋白(以干基计)/% 36.6±1.3 66.3±2.7 ≥18.0 氨基酸 赖氨酸/% 1.23±0.5 2.20±0.2 ≥0.35 蛋氨酸/% 0.87±0.06 1.47±0.03 ≥0.32 亮氨酸/%
2.91±0.03 4.00±0.02 异亮氨酸/%
1.45±0.09 4.12±0.07 苏氨酸/%
1.36±0.01
2.17±0.02 缬氨酸/%
2.42±0.02 2.95±0.03 苯丙氨酸/%
1.49±0.03
2.26±0.05 色氨酸/%
0.18±0.01 0.42±0.03 粗脂肪/% 2.0±0.1 4.2±0.2 ≥2.5
粗纤维/% 4.7±0.2 2.8±0.2 ≤6.0
酒精/%
4.5±0.1 1.3±0.3 黄曲霉毒素B 1/μg ·kg –1
5.00±0.08 能量/kJ ·(100g )–1
1600±200 表5 常见动物饲料粗蛋白含量对比
饲料种类 粗蛋白/% 参考文献
米糠粕
15.1 [18] 小麦麸
15.7 [19] 大豆粕 44.2 [20] 木薯干 2.5 [21] 鱼粉 52.5 [22] 肉骨粉
50.0 [23] 棉籽粕
43.5 [24] 黄酒糟米浆水真菌发酵产物
66.3
本研究
氨基酸种类
图3 常见动物饲料必须氨基酸含量对比
（鱼粉数据来源参考文献[22]；大豆粉数据来源参考文献[25]）
糟米浆水混合物中接种白地霉和产朊假丝酵母混菌（1∶1）真菌发酵后得到的发酵产物粗蛋白含量高于市场上现有动物饲料中的含量。

同时从图3
也可以发现，发酵产物除了赖氨酸外，其余7种必
须氨基酸含量均高于大豆和鱼粉这2种最常见的动物饲料，表明SCP 除了能够在一定程度上缓解
蛋白质饲料匮乏这一问题外，更能够补充动物自身无法合成的必要氨基酸，富含较高的营养价值。

与市场中比较成熟的鱼粉以及大豆粉饲料蛋白相比,利用黄酒生产废弃物发酵后的产物中不仅粗蛋白
含量更高,而且必须氨基酸的含量在营养成分上也
具有一定优势。

再者，鱼粉和大豆粉发酵产物的原
料来源是自然资源，生产成本较高，尤其近年来鱼
粉所使用的渔业生产资源减少，其价格高居不 下[26]，而利用酒精废弃物发酵生产的SCP 饲料则充分地实现了废物利用，成本低廉，具有一定的经济性和市场竞争力，的确具有替代市场上现有动物饲料的潜力。

将黄酒废弃物的发酵产物进行资源化利用的
同时，对废弃物的无害化处理也是重要的环节。

真
菌发酵技术可以有效地将废水中的有机物进行转
化，从而降低废弃物中的有机物浓度。

利用黄酒糟米浆水发酵时，对不同接种方式发酵后的液相基质测定了SCOD 转化率（表6）。

从表6中可知，采用单菌及混菌发酵均可对发酵基质中的SCOD 进行有效去除，其中混菌发酵后的去除效果最好，去除率可达78.13%。

表6 不同接种方式发酵基质SCOD 去除率
接种方式
SCOD 浓度/mg ·L –1 去除率/%
0天
4天
单菌（产朊假丝酵母）76200±1414 18280±396 76.01±4.1 单菌（白地霉） 72440±57 23640±509 67.37±2.2 混菌（1∶1）
77200±113 16880±113 78.13±8.1
3 结论
通过活化培养产朊假丝酵母和白地霉两种真菌，分别接种至木薯原糟、木薯上清液、黄酒酒糟米浆水和固态发酵基质黄酒糟中发酵4天，比较了单菌和混菌（1∶1）对干物质的产率和粗蛋白的含量的影响，筛选出最优的培养基质和接种菌株，得到以下结论。

（1） 4种基质发酵前后干物质的质量和粗蛋白的含量均有了不同程度的增加，其中黄酒糟米浆水的SCP 产率和粗蛋白含量最高，产朊假丝酵母单菌发酵第4天时，分别可达3.38和52.6%。

因此，从
化工进展 2018年第37卷·274·
研究所用的酒精废弃物中筛选出黄酒糟米浆水作为真菌发酵酒糟生产SCP的最适基质。

（2）用单菌和混菌分别对黄酒糟米浆水基质进行发酵，产朊假丝酵母-白地霉混菌发酵相比单菌发酵更能提高SCP产率与粗蛋白产量，SCP产率3.91，菌体生物量可达90.22g/L，粗蛋白含量可达53.3%。

（3）通过发酵产物的粗蛋白含量以及氨基酸组成分析，黄酒糟与米浆水发酵产物的粗蛋白含量及氨基酸组成均可与市场上的常用饲料媲美，具有作为动物饲料的潜力。

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