高灵敏荧光定量检测HCV-RNA在丙肝诊疗中的应用研究

2021年2月第11卷第3期
CHINA MEDICINE AND PHARMACY Vol.11 No.3 February 2021
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·检验医学·
高灵敏荧光定量检测HCV-RNA
在丙肝诊疗中的应用研究
吴嘉锐 王　军 梁连辉 邓纪望 李淑丽 何　娟 蔡常辉
广东省中山市第二人民医院检验中心，广东中山 528447
[摘要]目的 观察评价分析高灵敏荧光定量检测丙型病毒性肝炎病毒核酸（HCV-RNA）在丙型病毒性肝炎诊疗中的应用效果。

方法 选择2018年2月至2019年2月中山市第二人民医院肝病门诊及戒毒所体检可疑感染丙肝的患者临床血清样本126例，分别采用HCV 磁珠法试剂和对照试剂检测血清中RNA 水平。

结果 磁珠法试剂检测126例样本中有54例阳性，72例阴性；对照试剂检测126例临床样本中有44例阳性，82例阴性，磁珠法试剂定量检测血清中RNA 水平阳性率42.86%高于对照试剂34.92%（χ2=1.670，P =0.196）；磁珠法试剂和对照试剂的阳性样本具较好的一致性（P =0.0000），磁珠法试剂与对照试剂的定量检测结果具有线性相关(r =0.947，P ＜0.05)。

结论 磁珠法高灵敏荧光定量检测丙型肝炎病毒核酸（HCV-RNA）具有更高的灵敏度，是一种比较理想的HCV-RNA 定量检测试剂，值得临床大力推广应用。

[关键词] 丙型病毒性肝炎；丙型病毒性肝炎病毒核酸；高灵敏荧光定量；磁珠法
[中图分类号] R473.71 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2021）03-0175-04
Application research of highly sensitive fluorescence quantitative
detection of HCV-RNA in diagnosis and treatment of hepatitis C
WU　Jiarui WANG　Jun LIANG　Lianhui DENG　Jiwang LI　Shuli HE　Juan CAI　Changhui
Inspection Center, Zhongshan Second People's Hospital, Guangdong, Zhongshan 528447, China
[Abstract] Objective To observe, evaluate and analyze the application efficacy of highly sensitive fluorescence quantitative detection of HCV-RNA in diagnosis and treatment of hepatitis C. Methods A total of 126 clinical serum samples of patients suspected to be infected with hepatitis C through physical examination in hepatic disease clinic and drug rehabilitation center of Zhongshan Second People's Hospital from February 2018 to February 2019 were selected. Meanwhile, the RNA level in serum was detected by the HCV magnetic bead method reagent and the control reagent respectively. Results Among 126 samples detected by magnetic bead method, 54 cases were positive, and 72 cases were negative, 44 cases were positive, and 82 cases were negative in 126 clinical samples detected by the control reagent. The positive rate of serum RNA level in serum detected by magnetic bead method was 42.86%, which was higher than 34.92% of the control reagent (χ2= 1.670, P = 0.196). The positive samples of magnetic bead reagent and control reagent had good consistency (P = 0.0000). There was a linear correlation between the results of quantitative detection between magnetic bead reagent and control reagent (r = 0.947, P ＜ 0.05). Conclusion The magnetic bead method is an ideal reagent for quantitative detection of hepatitis C virus nucleic acid (HCV-RNA) with higher sensitivity, and it is worthy of promotion and application in clinic.
[Key words] Viral hepatitis C; Hepatitis C virus nucleic acid; Highly sensitive fluorescence quantification; Magnetic bead method
丙型病毒性肝炎（hepatitis C virus，HCV 简称“丙肝”）是较常见的一种肝脏疾病传染性疾病，呈全球流行，不同性别、年龄、种族人群均对HCV 易感，HCV 的感染具有隐匿性，丙型肝炎病毒也是导致肝硬化和肝细胞癌的主要危险因素[1-2]。

HCV 无或仅有轻微的临床症状和体征，缺乏特异性，临床诊断十分困难，必须依赖实验室诊断。

而实验室诊断中病原学的诊断是确定诊断的唯一依据。

HCV
基因组为单股正链 RNA，易变异，HCV 感染的实验室诊断包括抗原、抗体检测和HCV-RNA 定量检测，其中抗原的检测主要用于免疫缺陷等特殊患者的筛查，抗-HCV 检测主要用于一般HCV 感染者的初筛，血清 HCV-RNA 定量检测是实验室诊断丙型肝炎的金标准，且不同厂家试剂提取核酸方法不同，灵敏度和和特异性不同，直接影响临床诊疗方案的制定[3-5]。

中国HCV 防治现状可以概括为“三高三低”，就是说“高隐匿、高漏诊、高慢性化，认知
[基金项目] 广东省中山市医学科研项目（2018J147）
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率低、就诊率低、治疗率低”。

早诊断、早发现、早治疗是防控HCV 传染源和阻断传播途径最为有效的手段[6-7]。

新出现的
“磁珠法”提取核酸，提取效率高，操作步骤简单，重复性好，可溯源，可实现自动化，是未来核酸分离纯化方法发展的一个重要方向。

本研究通过高灵敏荧光定量检测丙型病毒性肝炎病毒核酸（HCV-RNA）在丙型病毒性肝炎诊疗中效果，取得满意的临床疗效，现报道如下。

1　资料与方法1.1　一般资料
选择2018年2月至2019年2月中山市第二人民医院（我院）肝病门诊及戒毒所体检可疑感染丙肝的患者临床血清样本126例，其中年龄19～62岁，平均（33.84±6.59）岁，纳入标准：①均符合《丙型肝炎防治指南》的慢性丙型肝炎诊断标准[8]；
②依从性良好，自愿配合本研究者；③所有丙型病毒性肝炎患者均经本院医学伦理委员会研究决定，知情并自愿签署同意书。

排除标准：①合并乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒等嗜肝病毒感染的患者；②具有发生肝硬化或者原发性肝癌的患者；③具有肝硬化、原发性肝癌及自身免疫性肝病的患者；④合并其他免疫系统疾病、精神疾病及孕妇或妊娠期妇女；⑤依从性差不能配合本研究的患者。

将所有体检可疑感染HCV 的患者临床血清样本126例，分别采用HCV 磁珠法试剂和对照试剂检测血清中RNA 水平。

1.2　方法
1.2.1　血液标本收集　收集肝病门诊及戒毒所体检可疑感染丙肝的血液标本，所有患者于入组后清晨空腹抽取外周静脉血3 ml 及5 ml，每位患者共2支标本，一支为EDTA(紫色管)3 ml，一支为红色无抗凝管5 ml；3000 r/min 离心10 min 取上清，-20℃储存。

1.2.2　研究方法　①分别用磁珠法提取核酸荧光定量PCR 试剂及柱提取核酸荧光定量PCR 试剂测定病毒核酸HCV-RNA 载量；②用酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay， ELISA）法检测丙肝核心抗原、抗体。

1.3　观察指标
观察分析采用磁珠法试剂和对照试剂检测血清中RNA 水平。

1.4　统计学处理
本研究数据采用SPSS 23.0统计学软件计算分析，计量资料以(x ±s )表示，
采取Kappa 检验分析，血清中RNA 水平比较采用χ2检验，P ＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果
2.1　磁珠法试剂和对照试剂检测血清中RNA水平的比较
磁珠法试剂检测126例样本中有54例阳性，72例阴性；对照试剂检测126例临床样本中有44例阳性，82例阴性，磁珠法试剂和对照试剂检测血清中RNA 水平阳性率比较，差异无统计学意义
（χ2=1.670，
P =0.196），见表1.表1 HCV磁珠法试剂和对照试剂定量检测血清中RNA水平的比较[n (%)]方法n 阳性阴性磁珠法试剂12654（42.86）72（57.14）对照试剂126
44（34.92）82（65.08）χ2值 1.670 1.670P 值
0.196
0.196
2.2　磁珠法试剂和对照试剂HCV荧光定量检测结果比较
126例临床样本的 HCV 荧光定量检测试剂的检测结果，见表 2。

表2 磁珠法试剂和对照试剂HCV荧光定量检测结果
组别n 01～1516～999
≥1000磁珠法试剂126702450对照试剂
126
82
44
2.3　磁珠法试剂和对照试剂高灵敏荧光定量检测结果一致性分析
磁珠法试剂和对照试剂检测结果阳性一致性为100.00%，阴性一致性为87.80%（72/82），总一致性为92.06% [（44+72）/126]。

对磁珠法试剂和对照试剂检测结果的一致性采取Kappa 分析，磁珠法试剂和对照试剂检测结果的存在显著一致性(Kappa =0.162，P =0.0000)，见表3。

表3 磁珠法试剂和对照试剂高灵敏荧光定量检测结果一致性分析磁珠法试剂对照试剂阳性
对照试剂阴性
合计阳性441054阴性07272合计
44
82
126
2.4　磁珠法试剂和对照试剂相关性分析
对磁珠法试剂和对照试剂检测结果都为阳性的 44 例样本，分别取对数值。

分析结果显示，磁珠法试剂与对照试剂的定量检测结果具有线性相关（r =0.947，P =0.003），磁珠法试剂与对照试剂的回归方程y = 0.634 x + 0.9000。

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3　讨论
目前全世界约有1.85亿人感染丙型肝炎病毒，HCV 是由丙型肝炎病毒引起的，感染率逐年增高，呈全球性流行，常规传播途径主要是母婴传播、医疗机械传播、经破损的皮肤和黏膜传播，全世界不同性别、年龄、种族人群均对 HCV 易感，且每年新增感染者约35万，以肝脏病变为主的传染性疾病，表现为急性和慢性病毒性肝炎（50%～85% 的丙型肝炎），其中慢性丙肝可发展成纤维化、肝硬化（10%～15% 的患者）甚至肝细胞癌，这就势必增加了肝癌的发生率，死亡人数也成倍增长[9-10]。

丙肝起病隐匿，大部分患者症状不明显，最新文献显示，75%～90%HCV 感染者未意识到自身的感染情况，80%HCV 感染者发展为慢性肝炎。

丙肝已经被公认为是造成全球慢性肝脏疾病的主要原因，约有27%肝硬化、25%肝癌是由丙肝引起的[11-12]。

对丙肝进行早期准确诊断、进行科学合理治疗和疗效监测具有重要的临床价值。

常规的诊断方法包括HCV-RNA、HCV 重组免疫法，丙肝已经成为不可忽视的公共卫生问题，应当进一步深入研究。

HCV 感染的实验室诊断包括抗原、抗体、和HCV-RNA 定量检测，其中抗-HCV 检测主要用于HCV 感染者的的初筛，抗原的检测主要用于免疫缺陷等特殊患者的筛查，高敏感度 HCV-RNA 定量检测已经成为丙肝治疗监测的趋势，而HCV-RNA 定量检测是唯一确定HCV 现症感染的实验室指标，作为典型的 ,HCV-RNA 病毒分裂，通常在检定过程中，被视作金标准[13]。

对于抗原或抗-HCV 阳性者，应进一步进行HCV-RNA 定量检测，以确定是否为丙型肝炎患者。

根据丙型肝炎防治指南（2015年更新版）意见，HCV-RNA 定量检测是诊疗丙肝的“金标准”，抗病毒治疗前病毒基线载量分析，抗病毒治疗过程中及治疗结束后的应答评估，均需要高灵敏准确丙肝核酸检测。

由此可见，选择一种高灵敏的丙肝核酸检测方法至关重要。

目前国内外丙肝核酸的检测方法有多种，质量也参差不齐，实验灵敏度相差甚远。

在各种方法中，血清或血浆样本中病毒核酸的提取手段，是影响HCV-RNA 定量结果最为关键的因素之一。

新出现的“磁珠法”提取核酸，提取效率高，操作步骤简单，重复性好，可溯源，可实现自动化，是未来核酸分离纯化方法发展的一个重要方向。

磁珠法核酸提取是以磁珠为载体，通过运用磁珠在高盐低pH 值下吸附核酸，在低盐高pH 值下与核酸分离的物理方法的原理过程，并采取移动磁珠或转移液体来实现
核酸的整个提取纯化过程[14-15]。

磁珠法
（MBM）提取核酸建立了一种快速、简便的血清或血浆病毒核酸提取方法。

我院检验中心使用MBM 来纯化核酸的最大优点就是自动化，省时省力，有效的降低了人工成本，提取方法简便、快捷。

磁珠在磁场条件下能够显著地进行聚集或分散,彻底摆脱离心等所需的手工操作流程，可以尽快的得到试验数据，有效地减少了试验成本，大大地降低了患者的经济负担且，且早日为患者的确诊及治疗争取了时间。

本研究结果显示，磁珠法试剂检测126例样本中有54例阳性，72例阴性；对照试剂检测126例临床样本中有44例阳性，82例阴性，磁珠法试剂和对照试剂的阳性样本具较好的一致性（P =0.000），磁珠法试剂与对照试剂的定量检测结果具有线性相关（r =0.947，P ＜0.05）。

本研究中采用磁珠法提取核酸高灵敏荧光定量检测HCV-RNA 在中山市乃首创，如能在中山市医疗系统重点单位顺利推广或为本区域患者集中检测，将为广大丙肝患者的抗病毒治疗带来新的认识，进一步取得新的疗效。

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（下转第187页）
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·麻醉与疼痛·
筋膜阻滞主要机制是利用局部麻醉药阻断腹股沟韧带下方的股神经，以及股外侧皮神经。

髂筋膜阻滞是一种侵袭性治疗，属于局部阻滞治疗的范畴，是通过注射方法，将镇痛抗炎药、麻醉药或皮质类固醇注射到髂筋膜病变部位，起到治疗髂关节炎的作用[5]。

第一步是通过超声引导进行定位，保证定位的准确性，估计所需的阻滞范围，并确定穿刺部位[10-12]。

超声引导下髂筋膜阻滞具有快速、定位准确等优点[13-15]，再配合静脉镇痛，镇痛效果显著，减轻患者疼痛。

综上所述，在髋部手术术后使用超声引导下髂筋膜阻滞复合静脉镇痛，镇痛效果显著，有效降低VAS 评分，且不良反应低，安全可靠，具有临床应用价值。

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（收稿日期：2020-07-28）
（上接第177页）
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