酵母双杂实验操作手册和注意事项

酵母双杂实验操作⼿册和注意事项
酵母双杂（Yeast two-hybrid）实验操作⼿册和注意事项⼀. 酵母双杂的原理
1989年，Song和Field建⽴了第⼀个基于酵母的细胞内检测蛋⽩间相互作⽤的遗传系统。

很多真核⽣物的位点特异转录激活因⼦通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain ，AD）。

这两个结构域各具功能，互不影响。

但⼀个完整的激活特定基因表达的激活因⼦必须同时含有这两个结构域,否则⽆法完成激活功能。

不同来源激活因⼦的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。

基于这个原理，可将两个待测蛋⽩分别与这两个结构域建成融合蛋⽩，并共表达于同⼀个酵母细胞内。

如果两个待测蛋⽩间能发⽣相互作⽤，就会通过待测蛋⽩的桥梁作⽤使AD与BD形成⼀个完整的转录激活因⼦并激活相应的报告基因表达。

通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋⽩分⼦间是否发⽣了相互作⽤。

酵母双杂交系统由三个部分组成：
(1)与BD融合的蛋⽩表达载体，被表达的蛋⽩称诱饵蛋⽩(bait)。

(2)与AD融合的蛋⽩表达载体，被其表达的蛋⽩称靶蛋⽩(prey)。

(3)带有⼀个或多个报告基因的宿主菌株。

常⽤的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。

⽽菌株则具有相应的缺陷型。

双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。

这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。

根据⽬前通⽤的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。

后者因其BD来源于原核⽣物，在真核⽣物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。

⼆.所⽤的载体及相关信息
1. pGBKT7载体的图谱和相关信息
The pGBKT7 vector expresses proteins fused to amino acids 1–147 of the GAL4 DNA binding domain (DNA-BD). In yeast, fusion proteins are expressed at high levels from the constitutive ADH1promoter (PADH1); transcription is terminated by the T7 and ADH1 transcription termination signals(TT7 & ADH1). pGBKT7 also contains the T7 promoter, a c-Myc epitope tag, and a MCS. pGBKT7replicates autonomously in both E. coli and S. cerevisiae from the pUC and 2 m ori, respectively. Thevector carries the Kan r for selection in E. coli and the TRP1 nutritional marker for selection in yeast.Yeast strains containing pGBKT7 exhibit a higher transformation efficiency than strains carrying other DNA-BD domain vectors (1).
b. pGADT7载体的图谱和相关信息
pGADT7-T encodes a fusion of the SV40 large T-antigen (a.a. 86–708) and the GAL4 AD (a.a. 768–881). The SV40 large T DNA (GenBank LocusSV4CG) was derived from a plasmid referenced in Li & Fields (1993) and was cloned into pGADT7 using the EcoR I and Xho I sites. pGADT7-T has not been sequenced.
三．实验主要流程
A.需要准备的药品和设备
1.两种酵母菌种(AH109,Y187)
2.酵母培养所需的药品: Yeast nitrogen base without amino acids
Agar (for plates only)
sterile 10×Dropout Solution
单缺-T,-L(clontech公司)
⼆缺-T/-L (clontech公司)
四缺-T/-L/-Ade/-His(clontech公司)
3.酵母转化所需的药品: 10×TE buffer
10×LiAc
40%PEG
carrier DNA
4.酵母显⾊所需要的药品: x- -GAL
5.其他仪器设备: 30℃恒温培养箱
30℃摇床.
⽔浴锅
分光光度计
B．DNA-BD和DN-AD fusion protein 载体的分别构建。

1．纯化基因⽚段。

2．⽤相应的酶对DNA-BD载体进⾏酶切和纯化。

3．连接酶切⽚段和载体，转化到E.coli 。

4．通过内切酶分析或PCR对载体进⾏分析鉴定。

以上步骤基本同⼀般载体的构建。

C. BD⾃激活作⽤的检测。

1.把载体转化到AH109和Y187中。

把转化产物在三种培养基中⽣长,⽤空的DNA-BD载体作阴性对照。

SD/-Trp/x-ａ-Gal、
SD/-His/-Trp/x-ａ-Gal、
SD/-Ade/-Trp /x-ａ-Gal。

2.分析结果
如果转化克隆是蓝⾊，在SD/-His/-Trp、SD/-Ade/-Trp 上可以⽣长，说明其⾃⾝激活报告基因转录，则不能⽤做诱饵蛋⽩。

D.融合蛋⽩毒性的测试
⽐较带有DNA-BD 融合蛋⽩载体和空的DNA-BD 载体的Y187和AH109的转化⼦菌系在液体培养中的⽣长效率。

如果bait菌系⽣长速率要明显慢很多，则此bait蛋⽩可能有毒性。

在SD/-Trp上筛选，如下准备过夜培养:
挑⼀个较⼤的克隆（2-3mm）在50ml SD/-Trp/Kan（20 ug/ml）培养液中⽣长。

30°，250-270rpm培养16-24h。

检查培养液的OD600值，它应当〉0.8。

若⼩于，则DNA-BD fusion可能有毒性。

如果没有妨碍⽣长，则是⾮毒性的，可以⽤来做双杂交筛选。

E.酵母的⼩规模转化⽅法
1.在1ml的YPD培养基中，接种酵母AH109(或Y187)。

2.震荡，打散细胞。

3.将细胞转移到20mlYPD中，锥形瓶的规格为250ml⽐较合适，较多地空⽓有利于酵母⽣
长。

30℃振荡培养12⼩时，OD600>1.6 /不⼤于2.0即可。

4.取合适的菌液⾄100mlYPD中，使OD600在0.2-0.3之间。

250rpm振荡培养3⼩时，直到OD600在0.4-0.6之间。

5.菌液移⼊50ml离⼼管中，室温下1000g,离⼼5分钟。

6.去上清，⽤25ml⽆菌⽔重悬细胞。

7.室温下1000g,离⼼5分钟。

再去上清液，⽤1.5ml 1×TE/1×LiAc轻轻重悬细胞，制成感
受态酵母菌。

8.分装感受态细胞，100µl为⼀管。

在每管中加⼊0.1µg的carrier DNA和0.1µg⽬的质
粒。

轻轻混合均匀。

9.加⼊0.6mlPEG/LiAc，⾼速振荡10秒钟。

10. 30℃,250rpm摇床,摇30分钟。

11.每管加⼊70µl的DMSO,轻轻的混匀,不要剧烈震荡。

12.在42℃⽔浴锅中,热激15分钟。

13.在冰上冷却1—2分钟。

14.在室温下.14000rpm⾼速离⼼5秒,去上清液。

15.⽤0.5ml的1×TE buffer悬浮细胞。

16.以适量的菌液涂平板,在30℃下,培养2-4天。

F.转化效率的计算
数出稀释平板上的克隆数⽬：克隆数*1000=#转化数/3ug 载体。

预期结果：〉1×106转化数/3ug 载体。

G.酵母质粒的抽提
1．细胞沉淀在250µl 抽提液中悬浮
2．加⼊20µl 0.45-0.55mm玻璃珠，重复悬浮震荡。

3．加⼊250µl 酚：氯仿，混匀。

4．15000g，离⼼3min。

5．取上清，加⼊3倍体积⽆⽔⼄醇，混匀。

6．15000g，离⼼5min。

⽤70%⼄醇洗涤沉淀。

7．20µl⽆菌⽔溶解。

质粒抽提液：10 mM Tris-Hcl，1 mM EDTA，200 Mm NaCl，PH8.0
四.⼏个重要的问题的说明和⼀些实验中的⼼得体会
注意问题⼀: 载体的构建需要考虑到移码问题。

在酵母双杂中，所⽤到的蛋⽩都是融合蛋⽩，基因本⾝的起始密码⼦A TG是不起作⽤的,所以特别要考虑到移码问题。

⽆论是AD-基因，还是BD-基因，都是如此。

在融合蛋⽩之间可以有⼀段连接序列，但必须是三的倍数，确保⽬的基因在表达时不会移码。

注意问题⼆：酵母感受态制备的⼼得。

酵母感受态的制备是个很重要和精细的过程。

感受态的状态不佳，极⼤地影响到酵转化的效率。

这⾥有两点要注意。

a.原始菌种接种的量。

在1ml YPD培养基中，接种AH109的克隆时，⼤于2-3mm的⼤克隆，接种⼀个；⼤⼩在2-3mm之间的克隆，接种2-3个；⼩于2mm的克隆，不能⽤于正常的接种，重新划板活化之后再⾏接种。

b.酵母转接时的OD值掌握。

对数⽣长期的酵母菌转接到100ml的YPD中，经验量:
1.6OD600 的原菌液，取4ml左右。

2.0OD600 的原菌液，取4ml左右。

OD600 ⼤于2.0，原菌液就不能使⽤了，影响活性。

注意问题三：PEG浓度的改良。

⼀般经典的酵母操作⼿册上，在酵母转化时，⽤到的PEG的浓度都是40%。

经过我的多次试验，40%的PEG所得到的转化效率不是最⾼的，35%的浓度为最好。

其配⽅改良如下：
PEG 50% 8ml 改良为PEG50% 7ml
10×LiAC 1ml ----------------------------- 10×LiAC 1.5ml
10×TE 1ml 10×TE 1.5ml
降低5% PEG浓度可以提⾼转化效率。

注意问题四：转化所⽤的质粒的量。

在酵母转化的时候，所⽤质粒的浓度和纯度都是很重要的指标。

经验浓度为200ng/µl 以上，纯度则是尽可能的⾼。

质粒的总量需要在1µg 以上。

注意问题五：AH109,Y187酵母菌种的保存和使⽤问题。

酵母的菌种长期不⽤的保存在-80℃冰箱中。

但经常要使⽤的菌种保存在4℃冰箱的平板上最好。

把克隆长到3mm⼤⼩的酵母菌种平板保存在4℃冰箱⾥，要⽤时就可以随时挑克隆了。

但平板的保存时限为⼀个⽉，每个⽉需要重新划线转移⼀次平板，以保证其活性。

直到酵母相关实验全部完成为⽌。

注意问题六：酵母菌落的颜⾊问题。

正常的酵母菌落颜⾊是纯⽩⾊的，但经过转化的酵母常常带有⼀定的微红⾊。

Y187的菌种基本不会变红，颜⾊是正常的。

⽽AH109的菌种中Ade 基因容易突变，从⽽导致酵母颜⾊的改变。

但微红⾊的酵母基本上不影响下⼀步的操作。

AH109经过酵母单转化之后，在平板上会有微红⾊，但共转化之后就没有红⾊了。

注意问题七：酵母双杂Mating的时间掌握。

⼀般认酵母双杂Mating的时间为16-24个⼩时。

我经过试验，Mating的时间上限为28
个⼩时，下限为14个⼩时。

以18个⼩时为最佳，低于14个⼩时的Mating是⼀定失败的。

酵母Mating的时间，是⼀个重要的试验参数。

注意问题⼋：pCL1，pGBKT7-T和pGBKT7-53的阳性对照的问题。

pCL1载体不能⽤做互作对照，互作对照使⽤BKT7-T和pGBKT7-53。

同时转⼊后个载体的酵母可以在相应的营养缺陷型培养基上⽣长。

注意问题九：酵母的显⾊问题。

蛋⽩互作到⼀定程度的酵母菌，可以在涂有x-α-Gal的平板上显⾊。

这⾥所⽤的显⾊剂是x-α-Gal。

⽽我们平时在⼤肠杆菌的蓝⽩斑筛选的时候所⽤的是x-β-Gal。

两者的价格和作⽤相差很⼤，不能混⽤。

注意问题⼗：酵母的划线问题。

最后得到的结果，是要在平板划线拍照的。

划线的质量好坏，严重的影响了结果的美观，同时也使结果的可靠性受到质疑。

划线使⽤的酵母菌液需要测量OD值，OD600值在0.5时划线最合适。

低于0.5的菌液往往造成划线的不连续，太⾼的菌液会使克隆长成⼀团，看不到清晰的酵母菌落。