5. 亲和层析
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酶酶底物底物类似物抑制剂辅因子辅酶金属底物底物类似物抑制剂辅因子辅酶金属离子等离子等抗体抗体抗原病毒细胞激素维生素抗原病毒细胞激素维生素白载体蛋白白载体蛋白外源凝集素外源凝集素多糖化合物糖蛋白细胞表面受体蛋白多糖化合物糖蛋白细胞表面受体蛋白细胞细胞核酸核酸互补碱基链段组蛋白核酸聚合物核酸结合互补碱基链段组蛋白核酸聚合物核酸结合蛋白蛋白受体蛋受体蛋理想载体的特性
加入过量的小分子伯氨基试剂封闭多余的活化基团
封闭的试剂有乙醇胺、葡萄糖胺、甘氨酸、谷氨酸、甘露 糖等。
①配基偶联量 (μmol／g 或μmol／ml)。
②样品吸附量 (mg／s或mg／ml)。
③化学稳定性 ④耐酸碱 抗氧化物，配基不降解。
如pH3～10。
1. 亲和层析实验流程 2. 吸附条件的选择
①竞争性洗脱
②离子强度洗脱 ③pH+离子强度洗脱 ④变性剂洗脱 ⑤化学断裂
①一步洗脱：非选择性洗脱。 ②分步洗脱：选择性洗脱。 ③梯度洗脱：选择性洗脱， 洗脱液浓度梯度变化
①0.5-1.0 mol／L NaCl中性盐处理，除去离子性
较强的杂质。
②异丙醇处理，除去疏水性较强的杂质。 ③6 mol／L 脲处理，除去中性分子杂质。 ④6mol／L 盐酸胍处理，除去中性分子杂质。
3. 洗脱条件的选择
4. 洗脱方式 5. 亲和介质的处理
6. 亲和层析介质的保存
1. 亲和层析实验流程
装柱、平衡与上样品 亲和层析 介质
洗去 未吸附杂质
预处理
洗脱 收集洗脱峰
层析柱：吸附容量、待分离物质的总量 平衡缓冲液：pH和pI、上样体积、温度和流速等 因素
多次吸附，使纯化对象与配基充分作用
第5章 亲和层析
一、亲和层析的特点
二、基本原理 三、亲和层析介质及制备
四、亲和吸附层析实验流程
①待分离物质与配基专一性结合，分辨率高，操作简
单，通过一次性操作即可得到较高纯度的分离物质。
②具有浓缩作用，可以从含量很低的溶液中得到高浓 度的样品，有的纯化倍数达几千倍。
③利用生物学的特异性进行分离，所以分离条件比较 温和，能够很好地保持样品原有的生物学性质
4. 不被乙醇、丙酮等有机试剂所破坏。
5. 能耐受6mol／L盐酸胍或7 mol／L尿素处理 6. 吸附剂能够再生并重复使用。
以生物大分子为配基的偶联反应
活化载体“接臂”
①溴化氰活化载体与蛋白质配基偶联反应
②环氧氯丙烷活化载体与蛋白质配基偶联反应
①短臂(未接臂)亲和介质
②长臂(接臂)亲和介质
在弱碱性pH下过夜或在Tris—HCl缓冲液(pH8)中2 GSH-Sepharose 4B亲和层析 分离谷胱甘肽转硫酶 CHOM-Sepharose 4B亲和层析 分离胰蛋白酶
平衡液： 25mmol／L磷酸盐缓冲液， pH7.4(含3mmol／L DTT， 1mmol／L EDTA， 200mmol／L NaCl) 洗脱液： 25mmol／L磷酸盐缓冲液， pH7.4(含3mmol／L GSH， 2mmol／L DTT)
平衡液：0.1mol／L，pH8.0 Tris-HCl缓冲液(内含0．5mol/LKCl， 50mmol／L CaCl2) 洗脱液：0.1mol／L，pH2.5 甲酸- 0.5mol／L KCl溶液
1. 在亲和层析时，为什么床体积比较小？为什么在此层析 过程中无亲和力的物质往往只能产生一个层析峰？ 2. 简述亲和力层析的分辨率比一般吸附层析高的原因。 3. 简述亲和层析和亲和吸附剂衍生物制备的一般过程。 4. 哪些条件影响载体上配体的偶联量？配体应具备哪些条 件？ 5. 在操作及应用方面，亲和层析与吸附层析、离子交换层 析、凝胶层析有哪些异同点？
①有机小分子类 酸类、核苷酸类等。 ②生物大分子类 质、抗原抗体类等。 ③染料 主要有蓝色葡聚糖、荧光染料等 主要有酶类、抑制剂类、蛋白 主要有苯基类、烷基类、氨基
纤维素(cellulose)
葡聚糖凝胶(sephadex) 聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Gel) 多孔玻璃(Bio-Glass) 琼脂糖凝胶(sepharose)
②专一亲和性要强，能有效地分离目标分子。 ③配基与目标分子结合后，在一定条件下能够被解吸
附，且不破坏目标分子的生物活性。
④在分离过程中配基与目标分子无空间阻碍。
酶----底物、底物类似物、抑制剂、辅因子（辅酶、金属 离子等） 抗体----抗原、病毒、细胞、激素、维生素----受体蛋 白、载体蛋白 外源凝集素----多糖化合物、糖蛋白、细胞表面受体蛋白、 细胞 核酸----互补碱基链段、组蛋白、核酸聚合物、核酸结合 蛋白
聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶(Ultro-gel)
最常用的几种活化剂： 溴化氰(CNBr) 环氧氯丙烷 1，4-丁二醚 戊二醛、高碘酸盐等。
1
配基的选择
2
3 4
载体的选择
活化剂与偶联反应 封闭
5
亲和介质的技术指标
配基必备条件： ①能与活化剂的活化基团发生偶联作用，偶联后不影
响配基和目标分子的专一结合特性。
①凝胶介质上的羟基容易被多种活化剂活化， 引入不同的基团。
②具有大孔性和亲水性，凝胶内部的羟基得到 活化，有较高的活化效率。 ③刚性较好，珠状结构对流动向的阻力最小， 分离效率高。 ④非特异吸附极低，理化性质较稳定。
1. 在较广的pH范围内正常工作
2. 对去污剂、解离试剂保持稳定
3. 用0.1mol／L NaOH或0.1mol／L HCl处理2～3h不引起凝 胶颗粒的变化。
（一）生物大分子的识别功能 （二）亲和层析原理示意 （三）亲和吸附剂结构特点
蛋白质的结合部位及各种结合力
酶：底物、抑制剂
底物类物 抗体：抗原、病毒 细胞 激素：受体 外源凝集素 ：糖蛋白 表面受体蛋白 核酸：互补碱基链段 组蛋白
亲和层析介质的配基有很多，归纳起来主 要有以下几类：
理想载体的特性： ①不溶于水，但具有高度亲水性。 ②具有多孔网状结构和良好的流动性和渗透性。 ③机械性能良好，在一定静水压下不变形。
④有足够数量的化学基团与大量的配基相偶联。
⑤化学惰性 ，无或微弱的非特异性吸附作用。 ⑥有良好的物理和化学的稳定性。
纤维素 葡聚糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 多孔玻璃 琼脂糖凝胶 交联琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶
亲和层析介质一般保存于溶胀状态，保存温度4～ 8℃，不可冷冻，否则会破坏凝胶的珠状结构。在保存溶 液中加入20％的乙醇或0．02％的硫柳汞以防止长菌。活 化的rhiol-Sepharose 4B或thiopropyl-Sepharose 6B带 巯基的介质不能用硫柳汞。
1. 样液体积的影响 2. 流速的影响
加入过量的小分子伯氨基试剂封闭多余的活化基团
封闭的试剂有乙醇胺、葡萄糖胺、甘氨酸、谷氨酸、甘露 糖等。
①配基偶联量 (μmol／g 或μmol／ml)。
②样品吸附量 (mg／s或mg／ml)。
③化学稳定性 ④耐酸碱 抗氧化物，配基不降解。
如pH3～10。
1. 亲和层析实验流程 2. 吸附条件的选择
①竞争性洗脱
②离子强度洗脱 ③pH+离子强度洗脱 ④变性剂洗脱 ⑤化学断裂
①一步洗脱：非选择性洗脱。 ②分步洗脱：选择性洗脱。 ③梯度洗脱：选择性洗脱， 洗脱液浓度梯度变化
①0.5-1.0 mol／L NaCl中性盐处理，除去离子性
较强的杂质。
②异丙醇处理，除去疏水性较强的杂质。 ③6 mol／L 脲处理，除去中性分子杂质。 ④6mol／L 盐酸胍处理，除去中性分子杂质。
3. 洗脱条件的选择
4. 洗脱方式 5. 亲和介质的处理
6. 亲和层析介质的保存
1. 亲和层析实验流程
装柱、平衡与上样品 亲和层析 介质
洗去 未吸附杂质
预处理
洗脱 收集洗脱峰
层析柱：吸附容量、待分离物质的总量 平衡缓冲液：pH和pI、上样体积、温度和流速等 因素
多次吸附，使纯化对象与配基充分作用
第5章 亲和层析
一、亲和层析的特点
二、基本原理 三、亲和层析介质及制备
四、亲和吸附层析实验流程
①待分离物质与配基专一性结合，分辨率高，操作简
单，通过一次性操作即可得到较高纯度的分离物质。
②具有浓缩作用，可以从含量很低的溶液中得到高浓 度的样品，有的纯化倍数达几千倍。
③利用生物学的特异性进行分离，所以分离条件比较 温和，能够很好地保持样品原有的生物学性质
4. 不被乙醇、丙酮等有机试剂所破坏。
5. 能耐受6mol／L盐酸胍或7 mol／L尿素处理 6. 吸附剂能够再生并重复使用。
以生物大分子为配基的偶联反应
活化载体“接臂”
①溴化氰活化载体与蛋白质配基偶联反应
②环氧氯丙烷活化载体与蛋白质配基偶联反应
①短臂(未接臂)亲和介质
②长臂(接臂)亲和介质
在弱碱性pH下过夜或在Tris—HCl缓冲液(pH8)中2 GSH-Sepharose 4B亲和层析 分离谷胱甘肽转硫酶 CHOM-Sepharose 4B亲和层析 分离胰蛋白酶
平衡液： 25mmol／L磷酸盐缓冲液， pH7.4(含3mmol／L DTT， 1mmol／L EDTA， 200mmol／L NaCl) 洗脱液： 25mmol／L磷酸盐缓冲液， pH7.4(含3mmol／L GSH， 2mmol／L DTT)
平衡液：0.1mol／L，pH8.0 Tris-HCl缓冲液(内含0．5mol/LKCl， 50mmol／L CaCl2) 洗脱液：0.1mol／L，pH2.5 甲酸- 0.5mol／L KCl溶液
1. 在亲和层析时，为什么床体积比较小？为什么在此层析 过程中无亲和力的物质往往只能产生一个层析峰？ 2. 简述亲和力层析的分辨率比一般吸附层析高的原因。 3. 简述亲和层析和亲和吸附剂衍生物制备的一般过程。 4. 哪些条件影响载体上配体的偶联量？配体应具备哪些条 件？ 5. 在操作及应用方面，亲和层析与吸附层析、离子交换层 析、凝胶层析有哪些异同点？
①有机小分子类 酸类、核苷酸类等。 ②生物大分子类 质、抗原抗体类等。 ③染料 主要有蓝色葡聚糖、荧光染料等 主要有酶类、抑制剂类、蛋白 主要有苯基类、烷基类、氨基
纤维素(cellulose)
葡聚糖凝胶(sephadex) 聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Gel) 多孔玻璃(Bio-Glass) 琼脂糖凝胶(sepharose)
②专一亲和性要强，能有效地分离目标分子。 ③配基与目标分子结合后，在一定条件下能够被解吸
附，且不破坏目标分子的生物活性。
④在分离过程中配基与目标分子无空间阻碍。
酶----底物、底物类似物、抑制剂、辅因子（辅酶、金属 离子等） 抗体----抗原、病毒、细胞、激素、维生素----受体蛋 白、载体蛋白 外源凝集素----多糖化合物、糖蛋白、细胞表面受体蛋白、 细胞 核酸----互补碱基链段、组蛋白、核酸聚合物、核酸结合 蛋白
聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶(Ultro-gel)
最常用的几种活化剂： 溴化氰(CNBr) 环氧氯丙烷 1，4-丁二醚 戊二醛、高碘酸盐等。
1
配基的选择
2
3 4
载体的选择
活化剂与偶联反应 封闭
5
亲和介质的技术指标
配基必备条件： ①能与活化剂的活化基团发生偶联作用，偶联后不影
响配基和目标分子的专一结合特性。
①凝胶介质上的羟基容易被多种活化剂活化， 引入不同的基团。
②具有大孔性和亲水性，凝胶内部的羟基得到 活化，有较高的活化效率。 ③刚性较好，珠状结构对流动向的阻力最小， 分离效率高。 ④非特异吸附极低，理化性质较稳定。
1. 在较广的pH范围内正常工作
2. 对去污剂、解离试剂保持稳定
3. 用0.1mol／L NaOH或0.1mol／L HCl处理2～3h不引起凝 胶颗粒的变化。
（一）生物大分子的识别功能 （二）亲和层析原理示意 （三）亲和吸附剂结构特点
蛋白质的结合部位及各种结合力
酶：底物、抑制剂
底物类物 抗体：抗原、病毒 细胞 激素：受体 外源凝集素 ：糖蛋白 表面受体蛋白 核酸：互补碱基链段 组蛋白
亲和层析介质的配基有很多，归纳起来主 要有以下几类：
理想载体的特性： ①不溶于水，但具有高度亲水性。 ②具有多孔网状结构和良好的流动性和渗透性。 ③机械性能良好，在一定静水压下不变形。
④有足够数量的化学基团与大量的配基相偶联。
⑤化学惰性 ，无或微弱的非特异性吸附作用。 ⑥有良好的物理和化学的稳定性。
纤维素 葡聚糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 多孔玻璃 琼脂糖凝胶 交联琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶
亲和层析介质一般保存于溶胀状态，保存温度4～ 8℃，不可冷冻，否则会破坏凝胶的珠状结构。在保存溶 液中加入20％的乙醇或0．02％的硫柳汞以防止长菌。活 化的rhiol-Sepharose 4B或thiopropyl-Sepharose 6B带 巯基的介质不能用硫柳汞。
1. 样液体积的影响 2. 流速的影响