高效液相色谱法测定特殊膳食中的烟酸和烟酰胺

高效液相色谱法测定特殊膳食中的烟酸和烟酰胺
李 越，方亚莉
（山西省食品药品检验所，山西太原 030031）
摘 要：目的：建立HPLC法测定特殊膳食中烟酸和烟酰胺的方法。

方法：采用热水提取，酸性沉淀蛋白质后，以C
18色谱柱分离，紫外检测器定量。

结果：烟酸和烟酰胺在0.00～8.00 µg/mL范围内均线性良好，定量限分别为0.9 mg/kg、1.2 mg/kg，回收率为91%～102%，RSD均小于20%。

结论：该方法适用于对特殊膳食中的烟酸和烟酰胺准确、快速的检测。

关键词：特殊膳食；烟酸和烟酰胺；高效液相色谱法
烟酰胺与烟酸统称为维生素PP，主要存在于动物内脏、肌肉组织中，水果、蛋黄中也有微量存在，在酵母、米糠、麦麸和肉类中含量丰富，是人体必需的13种维生素之一。

烟酰胺在体内与核糖、磷酸、腺嘌呤构成辅酶Ⅰ和辅酶Ⅱ，它们是许多脱氢酶的辅酶，在体内生物氧化中起脱氢和加氢作用，与很多代谢过程包括葡萄糖酵解、脂肪代谢、丙酮酸代谢和高能磷酸键的生成等有密切关系。

烟酸在体内转化为烟酰胺才能发挥上述作用。

此外烟酸还有较强的外周血管扩张作用[1]。

人体内烟酸不足时会影响糖的酵解、柠檬酸循环、呼吸链以及脂肪酸的生物合成，从而引起烟酸缺乏症。

目前，烟酸和烟酰胺的检测方法主要有微生物法[2]、高效液相色谱法[3]。

微生物法需在无菌条件下操作，成本较高，检验周期长，过程较复杂[4]。

本研究结合实验室现有设施条件，参照GB 5009.89—2016[5]中高效液相色谱法，选择特殊医学用途配方食品作为试验材料，建立了HPLC测定特殊膳食中烟酸和烟酰胺的方法。

1 材料与方法
1.1 材料与试剂
某品牌均衡型全营养配方粉；烟酸（来源：中国食品药品检定研究院，含量：99.9%）；烟酰胺（来源：SUPELCO，含量：99.9%）；盐酸；氢氧化钠；甲醇（色谱纯）；异丙醇（色谱纯）；庚烷磺酸钠（优级纯）；高氯酸（体积分数为60%）；实验用水为一级超纯水。

1.2 仪器与设备
岛津LC-2040高效液相色谱仪、超声波提取器、OHAUS AR224CN电子天平、OHAUS DV215CD 电子天平和酸度计。

1.3 试验方法
1.3.1 样品前处理
称取混合均匀固体试样约5.0 g（精确到0.01 g），加入约25 mL 45～50 ℃的水于150 mL锥形瓶中，将上述锥形瓶置于超声波振荡器中振荡约10 min，充分溶解，静置5～10 min，并冷却至室温。

待试样溶液降至室温后，用盐酸（5.0 mol/L 和0.1 mol/L）调节试样的pH值至1.7±0.1，放置约2 min后，再用氢氧化钠溶液（5.0 mol/L和0.1 mol/L）调节试样溶液的pH值至4.5±0.1。

将试样溶液转至100 mL容量瓶中，用水反复冲洗锥形瓶，洗液合并于100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀后经滤纸过滤，滤液再经0.45 μm微孔滤膜加压过滤，用样品瓶收集，即为试样待测液。

1.3.2 标准溶液及工作曲线配制
（1）标准储备溶液。

准确称取烟酸及烟酰胺标准品各
0.01 g，分别置于10 mL容量瓶中，用水溶解定容，配制成
1.0 mg/mL的标准储备液。

（2）标准工作系列的制备。

分别准确吸取标准储备液2 mL至50 mL容量瓶中，用水稀释定容，配制为40 μg/mL 的混合标准中间液。

根据检测需要，将混合标准中间液稀释配制成浓度为0 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、4.0 μg/mL和8.0 μg/mL的标准系列工作溶液。

1.3.3 液相色谱条件
色谱柱：C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温：25 ℃±0.5 ℃；进样体积：10 μL；流速：1.0 mL/min；紫外检测器：检测波长为261 nm；流动相：甲醇70 mL、异丙醇20 mL、庚烷磺酸钠1 g，用910 mL水溶解并混匀后，用高氯酸调pH至2.1±0.1，经0.45 μm膜过滤。

2 结果与分析
2.1 线性关系及检出限
将配制的标准系列工作溶液在上述仪器条件下进行测定，以峰面积Y为纵坐标、待测组分的浓度X为横坐标，绘制工作曲线，经线性回归后求得相关系数，结果见表1。

取0.03 μg/mL的烟酸标准工作液，0.04 μg/mL的烟酰胺标准工作液，在上述仪器条件下进行测定，由图谱得信噪比约为3∶1，故烟酸的检出限为30 μg/100 g，烟酰胺的检出限为40 μg/100 g。

定量限为检出限的3倍，烟酸和烟酰胺的定量限分别为0.9 mg/kg、1.2 mg/kg。

表1 目标化合物的线性回归参数及定量限
目标化合物线性范围/（μg/mL）工作曲线方程R2定量限/（mg/kg）烟酸0.00～8.00Y=20 766X–1 186.9 1.000 00.9
烟酰胺0.00～8.00Y=21 988X–1 442.70.999 9 1.2
（下转第83页）
V1-试样消耗盐酸标准溶液的体积，单位：mL；V0-试剂空白消耗盐酸标准溶液的体积，单位：mL；c-盐酸标准滴定液的实际浓度，单位：mol/L；V-试样体积，单位：mL）；0.014-与1.00 mL盐酸标准滴定溶液c(HCl)=0.100 mol/L相当的铵盐（以氮计）的质量，单位：g；100-换算系数。

2 结果与分析
2.1 蒸馏参数的选择
2.1.1 稀释液（H2O）用量
稀释液（H2O）用量分别为50 mL、60 mL、70 mL、80 mL、90 mL和100 mL，则铵盐量（以氮计）6次平均值分别为1.57 g/100 mL、1.57 g/100 mL、1.57 g/100 mL、1.56 g/ 100 mL、1.55 g/100 mL和1.52 g/100 mL，在相同的蒸汽量和蒸馏时间下，改变稀释液（H2O）体积，试验发现随着稀释液的增加，铵盐量变化不大，过多的稀释液反而可能影响碱液的浓度，从而影响铵盐量，稀释液选取50 mL。

2.1.2 蒸汽量
蒸汽量分别为50%、60%、70%、80%、90%和100%，则铵盐量（以氮计）6次平均值分别为1.42 g/100 mL、1.50 g/ 100 mL、1.57 g/100 mL、1.56 g/100 mL、1.56 g/100 mL和1.56 g/100 mL，在相同的稀释液和蒸馏时间下，随着蒸汽量的增加，在蒸汽量为70%以后蒸汽量的增加对测定的铵盐量变化不大，出于节约能源的原则，蒸汽量选择70%。

2.1.3 蒸馏时间
蒸馏时间分别为5 min、6 min、7 min、8 min和9 min，则铵盐量（以氮计）6次平均值分别为1.50 g/100 mL、1.57 g/ 100 mL、1.57 g/100 mL、1.56 g/100 mL和1.57 g/100 mL，在相同的稀释液和蒸汽量下，改变蒸馏时间，试验发现当蒸馏时间达到6 min及以上时就能很好满足条件，比传统的蒸馏方式至少快5倍。

2.2 实验验证
采用国标方法对本次实验用酱油中的铵盐进行测定[4]，多次测量取平均值1.57 g/100 mL；与采用福斯定氮仪测得的铵盐量（以氮计）相比，其RSD为1.16%，满足准确度要求。

3 结论
福斯凯氏定氮仪法相较于传统的半微量蒸馏法，可以节约时间成本以及人力成本，加快工作效率，实验更安全，数据更稳定。

另有研究表明离子色谱法通过测定阳离子（NH4+）来测定酱油中的无机铵盐[5]，由于酱油中的铵盐来源较多，该方法样品前处理时少了蒸馏环节，无法测算有机铵盐的含量，使得结果偏小。

当代检测技术日新月异，检验技术人员要紧跟时代步伐，不仅要学习专业的检测技术，更要关注检测方法的更新换代以及世界先进的检测仪器的发展趋向，为检测工作奉献出自己的力量。

参考文献
[1]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.酿造酱油:GB/T 18186—2000[S].北京:中国标准出版社,2000.
[2]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准食品中铵盐的测定:GB 5009.234—2016[S].北京:中国标准出版社,2016.
[3]钱英.酱油中铵盐的自动凯氏定氮仪测定法[J].职业与健康，2003(6):43-44.
[4]林崇昌,司徒小玉,邓秀燕,等.酱油中铵盐含量的监测与来源分析[J].中国食品卫生杂志,2011，23(4):362-364.
[5]王祖翔,余杨,孙莉,等.离子色谱法测定食品中的无机铵[J].食品与机械,2012(4):96-99.
2.2 方法回收率与重复性
分别称取样品5.0 g，加入适量的混合标准溶液，使得样品中目标化合物的加标浓度如表2中所示。

每个浓度进行6次平行试验，按照前述方法处理并上机测定，计算平均回收率及RSD，结果见表2，目标物的回收率为91%～102%，平均回收率为95%～102%，相对标准偏差均＜20%。

表2 烟酸和烟酰胺加标回收率及重复性试验结果
目标化合物加标量/μg回收率/（%）回收率均值±RSD/（%）
烟酸57.65291.75%～97.72%95.12±2.24 149.10096.86%～98.85%98.39±0.96 342.93097.91%～99.30%98.78±0.51
烟酰胺74.543 0101.12%～102.13%101.60±0.37 181.033 098.51%～99.86%99.18±0.47 367.390 599.21%～99.81%99.44±0.23
2.3 精密度与稳定性试验
本研究分别考察了7.952 0 μg/mL浓度水平的烟酸和8.519 2 μg/mL浓度水平的烟酰胺，分别在0 h、1 h、2 h、4 h、6 h和8 h后进样，计算其RSD，烟酸RSD为0.12%，烟酰胺RSD为0.20%。

表明方法精密度与稳定性良好。

3 结论
本研究建立的HPLC测定特殊膳食中烟酸和烟酰胺的方法，目标化合物保留时间相对稳定，线性关系、重复性、回收率、精密度和稳定性等考察结果良好，能够满足实验室对特殊膳食中烟酸和烟酰胺准确、快速、高通量的检测需求。

参考文献
[1]佚名.烟酸烟酰胺的概念[J].当代畜牧,2013(17):22.
[2]殷晓红,杨金宝,刘波,等.微生物法测定食品中的烟酸和烟酰胺[J].中国乳品工业,2003,31(2):32-35.
[3]唐销蓉,蒋涛,于艳屏,等.乳粉中三聚氰胺和烟酸烟酰胺测定方法的研究[J].中国食品工业,2012(12):46-47.
[4]周思渝.微生物法测定食品中烟酸和烟酰胺[J].现代食品,2020(12):3.
[5]国家卫生和计划生育委员会,国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准食品中烟酸和烟酰胺的测定: GB 5009.89—2016[S].北京:中国标准出版社,2016.
（上接第79页）。