高效液相色谱

高效液相色谱仪（HPLC）
开机
先打开电脑，然后从左往右开。

在waters600上按底下横排第二个键（Direct）→set：35（柱子温度）
测B组、叶酸冲机器甲醇流动相二次水
A B C D
100（过一下）
抽水流速（0.10）
100（过一下）
抽水（流速0.10）
3070
各至少40分钟流量为0.5、1.0一点一点往上调
7030
100
3070
3070
做样结束后调流速为1.53070
冲仪器。

自动进样器：打开开关按纽，按第三个键（PURGE PAGE），再按第一键（AUTO PAGE）冲洗针头。

过一会等所有按纽跳到第一个键（START PUGRE）显深色后，按最后一个键，回到主菜单，关机。

（这是每次做盐类产品做完后在关主机之前冲洗针头）
（注：在测完D3后应该在第二天早上要冲洗针头）打开开关按纽，按第三个键（PURGE PAGE），再按第一键（AUTO PAGE）冲洗针头。

过一会等所有按纽跳到第一个键（START PUGRE）显深色后，按最后一个键，再按最后第二个键YES。

然后再最后一个键，回到主菜单。

打印的报告中的PDA的结果表中看：纯度1角度＜纯度1阈值说明不受杂质影响（较好）计算标样含量：标样质量*标品浓度*掩盖系数*1000000/50（容量瓶定容体积）/进样品稀释倍数（掩盖系数VB1*0.787VB6*0.823）
计算样品含量：样品面积/标品面积*标品含量*100/样品质量（ug/ml）
建立方法：计算好标样含量后先选中标品浓度最低的然后按住ctrl键再选中其它浓度和第一个样品右击鼠标选择处理→选使用…..输入要建立的方法名（如VB3、VB6等）确定。

在通道中双击样品（第一个）点击峰形再右击鼠标选中提取色谱再右击选中提取光谱输入波长回车。

选中工具栏中处理方法向导按步骤做下去至完成，选择处理方法象二本书样子的图标选适用性输入1，选文件中的保存处理方法，再选方法组图标象一本书样子的输入方法（如VB3），选文件中的保存处理方法→直至保存。

查用曲线：选中标品浓度最低的然后按住ctrl键再选中其它浓度和第一个样品右击鼠标选择处理→选使用…..输入要建立的方法名（如VB3、VB6等）确定。

选择曲线按更新看曲线。

选择结果更新，双击样品可以打印报告。

仪器如长时间不用（如放假），在不用之前各通道都应用甲醇冲一下
A B C D
10020100
以防止长菌（水容易长菌）。

0.1mol的盐酸配制：4.5毫升盐酸+500毫升水
0.01mol的盐酸配制：把0.1mol的盐酸稀释10倍（即90毫升0.1mol的盐酸+810毫升二次水）。

用浓度计算样品重量＝浓度*体积*质量（分子量）
VD3（时间15-18分钟）
VD3（直接萃取法）样品处理（水溶性的样品）
称样5克+600毫克水解蛋白酶（最多至650毫克，再多含量会偏高）+20毫升千分之0.2氨水超声波超20分钟放置一会儿再摇匀→加无水乙醇定容至100毫升→离心。

在100毫升的容量瓶中加入5毫升水+20毫升正庚烷混合液，放至备用。

等上述样品离心好后吸取20毫升（用胖肚移液管移，移液管要先用无水乙醇润洗）加入以上备用液中（与正庚烷之比是1：1）。

充分摇匀倒入15毫升离心管中离心→吸1毫升至进样瓶（移液枪）→上HPLC进样。

VD3（皂化法）样品处里（脂溶性的样品）
皂化：称样至圆底烧瓶10克+1克左右VC钠（目的是抗氧化）+20毫升水摇匀（不要让其结块）+35毫升水摇匀+100毫升无水乙醇摇匀+55毫升无水乙醇摇匀+氢氧化钾放入100℃水浴锅中（隔几分钟摇晃一下，防止氢氧化钾粘在瓶避上）40分钟左右，取出放入冰箱中。

提取：取出冰箱中的样品倒入分液漏斗中，用水润洗装样品的圆底烧瓶2次，再用无水乙醇润洗圆底烧瓶，洗液并入分液漏斗中的样品中，加入100毫升石油醚，取下分液漏斗将样品摇匀，边摇边放气，摇匀后静止样品，分液漏斗的瓶盖用水冲洗一下，将下层沉淀放入圆底烧瓶中，取上层清液放入碘瓶中。

再将放出的样品倒入分液漏斗中，加入50毫升石油醚将样品摇匀，边摇边放气，摇匀后静止样品，分液漏斗的瓶盖用水冲洗一下，将下层沉淀再放入圆底烧瓶中取上层清液放入碘瓶中。

这样重复萃取3次。

倒掉放出的残渣。

将3次回收的上层清液合并倒入分液漏斗中，用水清洗，使放出的水呈中性（即：水洗至用酚酞指示剂至红色消失为至）。

用砂芯漏斗过滤（加药棉加无水硫酸钠）。

用石油醚再润洗分液漏斗，并入用砂芯漏斗过滤。

倒入圆底烧瓶中（要干净的，先在烧瓶中加抗氧化剂BDT），再在40℃的旋转蒸发器上蒸发，收取石油醚至圆底烧瓶中剩下不多的样品后取出，倒入试管中加盖备用。

把备用样品用氮气吹干（吹样品时应该注意不能让样品吹至外面），吹干后加入1毫升正庚烷（正庚烷用移液管移）摇匀再用超声波超一下过滤（用有机滤膜）至进样瓶。

做D3前先用异丙醇冲仪器再用正庚烷冲先A 100（异丙醇）再A 100（正庚烷）最后A 100（流动相）
VD3标品：称样0.01克左右用正庚烷定容至50毫升，做成三个稀释度100倍20倍5倍用正庚烷稀释。

50ul或200ul（成品）
计算标样含量：标样质量*标品浓度*1000000/50（容量瓶定容体积）/进样品稀释倍数*40（D3换算系数是因为原ug/ml换算成IU/ml）
计算样品含量：样品面积/标品面积*标品含量*100/样品质量*1.07（直接萃取）
样品面积/标品面积*标品含量*100/样品质量*1.25（皂化）
流动相：5毫升正戊醇（用移液枪移）+正庚烷大约500毫升1%左右
A
100
测VD3结束后有时间的话先A通道100%用异丙醇冲机器。

先流速调至0.10抽水再调至0.30再至0.60最高至0.60（因为异丙醇黏度较高），冲40分钟再换正庚烷。

如来不及没有时间直接用正庚烷冲洗机器。

换柱子前先用正庚烷冲一下（如前一天已用异丙醇冲的时间足够
了的话，如异丙醇冲的时间不够，应还要用异丙醇冲，再用正庚烷冲）。

波长：265nm
换柱子：D的柱子换成B组柱子。

先把D的柱子用异丙醇冲再正庚烷冲，取下柱子。

用甲醇在A通道100空冲（即不装柱子），流速为1.0。

接上柱子再用甲醇100冲，流速为1.0。

换柱子：B的柱子换成D组柱子。

取下柱子后用水空冲100%流速3.0（慢慢调高，这是冲进样器和泵）再接上原先的样子A100%（甲醇）流速1.0，冲检测器，再取下柱子。

接D的柱子：先空冲异丙醇30分钟以上流速为1.0，接上D的柱子先用异丙醇，后正庚烷各冲30分钟以上接流动相。

注意：测成品时如果两个峰分不开时，应该把在出峰前后3分钟流出来的废液接起来再用反向法测，来比较两个值的结果。

VB1、VB2、VB3、VB6、烟酸（时间18分钟第一个以后的可以改）
称标品：
如果VB3和烟酸同时测：应该这两种标品分别称量。

因为这两个出峰时间较接近。

VB2标品可少一些，一般少于0.0110克（太多会不准）
VB1、VB6一般在0.0140克
烟酸、VB3可以多一些0.0450克
VB2用0.01molHCL溶解，放入超声波超至溶解（60℃）冷却→200毫升（最后用水定溶）VB1、VB3、VB6、烟酸混合用0.01molHCL溶解，摇匀放置→50毫升（最后用水定溶）
标品稀释成10倍、5倍、2倍（用0.01molHCL稀释）→上进样器。

10ul
样品处理：称1克左右用0.01molHCL溶解，放入60℃的超声波中超18分钟（放入超声波中超之前样品溶液不能放置太久），放入水中冷却→100毫升（用水定溶）→过滤至进样瓶中→上进样器。

10ul
计算标样含量：标样质量*标品浓度*1000000/50（容量瓶定容体积）/进样品稀释倍数
VB1标样含量：标样质量*标品浓度*0.787*1000000/50（容量瓶定容体积）/进样品稀释倍数VB6标样含量：标样质量*标品浓度*0.823*1000000/50（容量瓶定容体积）/进样品稀释倍数VB2标样含量：标样质量*标品浓度*1000000/200（容量瓶定容体积）/进样品稀释倍数
VB3、烟酸标样含量：标样质量*标品浓度*1000000/50（容量瓶定容体积）/进样品稀释倍数计算样品含量：样品面积/标品面积*标品含量*100/样品质量
流动相：1‰辛烷磺酸钠
配制方法：称1.18克左右的辛烷磺酸钠加入1000毫升（用量桶量取）二次水中（500毫升水中加0.59克）放入超声波中超至溶解+1.48克左右的磷酸二氢钾（500毫升中加0.74克）置超声波中超至溶解+5000ul（用移液枪移）三乙胺摇匀用磷酸调PH至2.4备用。

甲醇流动相
A B C D
30 70
波长VB1、VB2、VB3、烟酸265nm
VB6292nm
注：测B组维生素如其中含有铁应加1克DTPA（二乙稀三胺五乙酸）掩盖铁。

VB3（含量较低，成品中的VB3检测方法）（国标法）（时间7分钟）
标品：称标样0.0120G用0.01molHCL溶解→50毫升（最后用水定溶）。

稀释10倍、5倍、1倍（用二次水稀释）→上进样器。

样品处理：称样5克左右至50毫升容量瓶中+25毫升水摇匀超声波超12分钟冷却倒入烧杯中用20%HCL调节PH至1.3左右再用10%氢氧化钠调节PH至4.5（在接近4.5不到一点时用事先配好的更稀的氢氧化钠调节，因为接近终点时它有一个突变）再倒回50毫升的容量瓶中定容→过滤至进样瓶→上进样器。

计算标样含量：标样质量*标品浓度*1000000/50（容量瓶定容体积）/进样品稀释倍数
计算样品含量：样品面积/标品面积*标品含量*100/样品质量
流动相：辛烷磺酸钠
A（甲醇） C
30 70
叶酸(注意避光)（时间12分钟）
称标品：标品称0.014克左右+二次水+3-4滴氨水至超声波超，冷却→50毫升。

标品溶液的稀释液：量10毫升二次水+0.5毫升乙腈+0.1毫升乙酸
稀释100倍、50倍、20倍→上进样器。

20ul
样品处理：称样0.1-0.2克左右至烧杯中+50毫升二次水用1+3的氨水调PH至8-10移入100毫升容量瓶（用二次水）超声波超20分钟，冷却→100毫升→过滤至进样瓶→上进样器。

20ul
注：如样品需稀释也用标品稀释液。

计算标样含量：标样质量*标品浓度*1000000/50（容量瓶定容体积）/进样品稀释倍数
计算样品含量：样品面积/标品面积*标品含量*100/样品质量
流动相：1‰辛烷磺酸钠
A B C D
30 70 先冲洗
100 抽一下
30 70 再走基线至少40分钟再做样
波长：285
泛酸（时间15分钟）
标品：用0.01molHCL溶解，摇匀放置→50毫升（最后用水定溶）
稀释10倍、5倍、1倍（用0.01molHCL稀释）→上进样器。

10ul
样品处理：称1克左右用0.01molHCL溶解，放入60℃超声波中超18分钟（放入超声波中超之前样品溶液不能放置太久）也可以用冷水超声波超（阿拉蒙牛的预混料），放入水中冷却→100毫升（用水定溶）→过滤至进样瓶中→上进样器。

计算标样含量：标样质量*标品浓度*0.9201*1000000/50（容量瓶定容体积）/进样品稀释倍数
计算样品含量：样品面积/标品面积*标品含量*100/样品质量
用浓度计算样品重量＝浓度*体积*质量（分子量）（计算磷酸二氢钾质量）
流动相：磷酸二氢钾（500毫升左右水+3.4克左右磷酸二氢钾）调PH＝3.0（用磷酸调）配成流动相0.05molKH2PO4（磷酸二氢钾）
乙腈
A B C D
3070
7030
100
20 80 先冲洗
80 20
20 80
100 抽一下
5 95 再走基线至少40分钟再做样
波长：205
VB12（时间8分钟）（柱温30℃）
标品：称标品0.01克左右至50毫升容量瓶中用流动相溶解定容至50毫升（最后用流动相定溶）
稀释100倍、50倍、20倍（用流动相稀释）→上进样器。

进样量20UL。

样品处理：预混料称2克左右用二次水溶解，放入冷水超声波中超15分钟（放入超声波中超之前样品溶液不能放置太久）→100毫升（用二次水定溶）→过滤至进样瓶中→上进样器进样量100UL。

(含量较低27-42UG/ML 江山）
样品处理：1%、0.1%的VB12称0.2克左右用二次水溶解，放入冷水超声波中超15分钟（放入超声波中超之前样品溶液不能放置太久）→100毫升（用二次水定溶）→过滤至进样瓶中→上进样器。

（1%的VB12需稀释10倍。

）进样量20UL
计算标样含量：标样质量*标品浓度*1000000/50（容量瓶定容体积）/进样品稀释倍数
计算样品含量：样品面积/标品面积*标品含量*100/样品质量
流动相：1‰已烷磺酸钠。

称已烷磺酸钠0.3克左右+250毫升二次水中（用量筒量）超声波超溶解+5毫升四丁基磷酸氢铵摇匀超声波超22分钟，用磷酸调PH值至3.0超声波再超22分钟即可备用。

A B C D
30 70 先冲洗
100 抽一下
25 75 再走基线至少40分钟再做样
波长：360
柱子用300MM*40MM，10UM
烟酸（时间6分钟）
标品：用0.01molHCL溶解，摇匀放置→50毫升（最后用水定溶）
稀释5倍、2倍、1倍（用0.01molHCL稀释）→上进样器。

样品处理：称1克左右用0.01molHCL溶解，放入60℃的超声波中超18分钟（放入超声波中超之前样品溶液不能放置太久）也可以用冷水超声波超，放入水中冷却→100毫升（用水定溶）→过滤至进样瓶中→上进样器。

计算标样含量：标样质量*标品浓度*1000000/50（容量瓶定容体积）/进样品稀释倍数
计算样品含量：样品面积/标品面积*标品含量*100/样品质量
流动相：1‰辛烷磺酸钠
A B C D
30 70 先冲洗
100 抽一下
30 70 再走基线至少40分钟再做样
波长：265
荧光法
VB1 （时间8分钟）
标品：用0.01molHCL溶解，摇匀放置→50毫升（最后用水定溶）。

稀释100倍、400倍、1000倍（用二次水直接稀释进离心管中）移入10毫升离心管中+500ul铁氰化钾（用移液枪移）+1毫升正丁醇（用大肚移液管移）→离心机离心→移入进样瓶。

→上进样器。

样品处理：称样2.2左右至三角瓶中+50毫升二次水（用量桶量）+0.1mol/LHCL(现配)即加0.45毫升HCL灭菌30分钟→冷却+2.5毫升淀粉酶{酶的配制方法：2mol/l无水乙酸钠（即50ml水+6.56克无水乙酸钠）放入超声波超溶解+1.44克木瓜蛋白酶+1.44克淀粉酶搅匀，放超声波溶解，置暗处。

}→37℃培养箱至过夜，调PH＝6.0（NaOH）移入100毫升容量瓶中定容→样品过滤至稀释管中用移液枪移1000ul至离心管中+500ul铁氰化钾（用移液枪移）+1毫升正丁醇（用大肚移液管移）→离心机离心→移入进样瓶（尽量不要碰到底下离心物，可以少一点900ul。

）→上进样器。

铁氰化钾：0.2克+2毫升二次水溶解+4克氢氧化钠水溶液（估计10%）混匀。

计算标样含量：标样质量*标品浓度*1000000/50（容量瓶定容体积）/进样品稀释倍数
计算样品含量：样品面积/标品面积*标品含量*100/样品质量
流动相：0.05mol/l无水乙酸钠（500毫升二次水+2.0581克无水乙酸钠溶解，超声波超用冰乙酸调PH至4.5，用真空泵过滤再超声波超20分钟。

A（甲醇） C
35 65
激发波长375
发射波长435
VB2 （时间7.5分钟）
标品：用0.01molHCL溶解，超声波超20分钟冷却备用→50毫升（最后用水定溶）。

稀释100倍、400倍、1000倍（用二次水稀释）→上进样器。

样品处理：称样2.2克左右至三角瓶中+50毫升水+0.1mol/LHCL(现配)即加0.45毫升HCL 灭菌30分钟→冷却+2.5毫升淀粉酶→37℃培养箱至过夜，调PH＝6.0（NaOH）移入100毫升容量瓶中定容→过滤至进样瓶→上进样器。

计算标样含量：标样质量*标品浓度*1000000/50（容量瓶定容体积）/进样品稀释倍数
计算样品含量：样品面积/标品面积*标品含量*100/样品质量
流动相：0.05mol/l无水乙酸钠（500毫升二次水+2.0581克无水乙酸钠溶解，超声波超用冰乙酸调PH至4.5，用真空泵过滤再超声波超20分钟。

A（甲醇） C
40 60
激发波长426
发射波长522
VB6 （时间16分钟）（国标法）
标品：用0.01molHCL溶解→50毫升（最后用水定溶）。

稀释100倍、400倍、1000倍（用二次水稀释）→上进样器。

样品处理：称样5克左右至50毫升容量瓶中+25毫升水摇匀超声波超12分钟冷却倒入烧杯中用20%HCL调节PH至1.3左右再用10%氢氧化钠调节PH至4.5（在接近4.5不到一点时用事先配好的更稀的氢氧化钠调节，因为接近终点时它有一个突变）再倒回50毫升的容量瓶中定容→过滤至进样瓶→上进样器。

计算标样含量：标样质量*标品浓度*1000000/50（容量瓶定容体积）/进样品稀释倍数
计算样品含量：样品面积/标品面积*标品含量*100/样品质量
流动相：辛烷磺酸钠
A（甲醇）C如出峰很慢应调流动向AC
5 952575
激发波长293
发射波长395。