免疫比浊检验技术原理与进展 ppt课件

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3、免疫学检测技术
凝集放射性核素标记 酶标记、荧光标记和胶 体金标记 化学发光物标记或偶联 化学发光反应
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标记免疫检测技术
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二、免疫沉淀
凝集：细菌、螺旋体和红细胞等颗粒抗原，在适当电解质 参与下可直接与相应抗体结合出现凝集，称为凝集反应 （agglutination）是最经典的免疫学检测技术。
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半抗原 +
载体
完全抗原
B B B
B Th
Th
抗体
半抗原—载体效应示意图
PPT课件 半抗原 + 蛋白质（载体） ＝ 完全抗原 9
1、抗原与抗体
抗原决定簇：抗原分子存在的能TCR/BCR或抗体Fab片 段特异性结合的特殊化学基团，是免疫应答特异性的 物质基础。 构象决定簇 ：构象决定簇（conformational determinant） 由空间构象形成的决定簇，序列上不连续。 顺序决定簇：顺序决定簇（sequence determinant），又 称线性决定簇（linear determinant），序列相连续的 氨基酸肽片段构成的决定簇。 抗原结合价：抗原结合价（antigenic valence）是指能够 与抗体分子结合的决定簇数目。
免疫比浊分析技术原理与进展
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免疫比浊检验技术原理与进展
一、免疫学基本原理 二、免疫沉淀 三、免疫比浊技术原理
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一、免疫学基本原理
1、抗原与抗体 2、抗原抗体的结合——免疫学反应 3、免疫学反应的检测技术
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1、抗原与抗体

抗原（Antigen, Ag）是刺激机体产生免疫应 答的物质。 “应” 是指抗原刺激机体产生免疫应答产物-抗体或免疫效应细胞 “答” 是指相应抗原与免疫应答产物结合并 将其排除体外） 抗原的免疫原性和免疫反应性 完全抗原与半抗原 抗原表位与抗原结合价位
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1、抗原与抗体
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1、抗原与抗体

免疫原性 免疫原性（immunogenecity）是指 抗原分子能够刺激机体产生免疫应答（产生特 异性抗体及免疫效应细胞）的性质。
T 致敏T细胞
Ag
B 活化浆细胞
免疫原性示意图
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抗体
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1、抗原与抗体

免疫反应性：是指抗原分子与免疫应答产物 （抗体或免疫效应细胞）发生特异性结合的性 质。
7.5秒
2分钟
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散射免疫比浊法

速率散射比浊分析
基本原理： 抗原抗体结合反应的一种动态测定法，适时检测抗原抗体复合物形 成的散射光信号。是测定抗原抗体结合反应的动态过程。
— 所谓速率，是在单位时间内抗原抗体结合形成复合物的速度。将各单位时 间内形成复合物的速率及测定的散射信号连接在一起，即是动态的速率比浊分 析。 — 当仪器测定到某一时间内形成速率下降时，即出现速率峰，该峰值的高低， 即代表所测抗原的量。 — 速率峰值一般在25秒时出现。 — 在反应介质中加入一定量的促凝剂，可加速抗原抗体复合物的形成，以减 少反应时间。 — 速率法的优点：是快速、不需要减去样本和试剂本底读数，校正结果也较 稳定。

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散射免疫比浊法
原理
抗原抗体复合物对一定波长的光产生折射、 偏转，偏转角度及散射光强度与复合物粒子的 大小和量有关
单色器
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散射免疫比浊法

定时散射比浊分析
基本原理： 免疫沉淀反应和散射比浊分析结合之技术，反应分两个阶段，预 反应阶段和反应阶段 保证抗原不过量的方法： 确保反应体系抗体过量 对抗原过量进行阈值限定
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絮 状 沉 淀 示 意 图
Ag
各管抗原倍比稀释
加入抗血清
1:2
1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128
各管抗体量不变
Ab
Ag
振摇 混匀、37℃孵育
沉淀量不同
轻摇
PPT课件 试管内絮状沉淀试验 30
单 向 琼 脂 扩 散 试 验
凝胶内沉淀——试管法
Ag Ab
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染色琼脂图
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三、免疫比浊技术原理
当可溶性抗原与相应抗体特异结合，二者比例合适时，在特殊 的缓冲液中它们快速形成一定大小的抗原抗体复合物，使反应液 体出现浊度。利用现代光学测量仪器对浊度进行测定从而检测抗 原含量。
平光线
射 散
透射光
光源 透镜 滤光片
检测器
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比浊测定法原理示意图
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透射免疫比浊法
缺陷
灵敏度较低。要求抗原－抗体复合物分子应足够大、足 够多，分子太小则入射光直接通过。加增敏剂。 直线光路，灵敏度有先天缺陷。设计散射比浊。 透射比浊是依据透射光减弱的原理来定量的，因此只能 测定抗原－抗体反应的第二阶段，检测仍需抗原－抗体 温育反应时间，检测时间较长。


影响抗原抗体反应的因素
电解质（离子强度）：抗原与抗体发生特异性结合后，虽由亲水胶体变为 疏水胶体，若溶液中无电解质参加，仍不出现可见反应。为了促使沉淀物 或凝集物的形成，常用0.85％氯化钠或各种缓冲液作为抗原及抗体的稀释 液。由于氯化钠在水溶液中解离成Na+和C1－，可分别中和胶体粒子上的 电荷，使胶体粒子的电势下降。当电势降至临界电势（12～15mV）以下 时，则能促使抗原抗体复合物从溶液中析出，形成可见的沉淀物或凝集物。 酸碱度（pH）：抗原抗体反应必须在合适的pH环境中进行。蛋白质具有 两性电离性质，因此每种蛋白质都有固定的等电点。抗原抗体反应一般在 pH为6～8进行。PH过高或过低都将影响抗原与抗体的理化性质，例如pH 达到或接近抗原的等电点时，即使无相应抗体存在，也会引起颗粒性抗原 非特异性的凝集，造成假阳性反应。 温度：在一定范围内，温度升高可加速分子运动，抗原与抗体碰撞机会增 多，使反应加速。但若温度高于56℃时，可导致已结合的抗原抗体再解离， 甚至变性或破坏；在40℃时，结合速度慢，但结合牢固，更易于观察。常 用的抗原抗体反应温度为37℃。每种试验都有其独特的最适反应温度，例 如冷凝集素在4左右与红细胞结合最好，20℃以上反而解离。 其它：适当振荡也可促进抗原抗体分子的接触，加速反应。

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2、抗原抗体的结合——免疫学反应
典型的抗原抗体结合反应
特异性识别
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形成抗原抗体复合物
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2、抗原抗体的结合——免疫学反应
抗原抗体反应的特点
特异性 按比例
可逆性
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2、抗原抗体的结合——免疫学反应
Antigen added →
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2、抗原抗体的结合——免疫学反应
根据轻链C区抗原性不同，免疫球蛋白可分 为 2型 ) κ(kappa)型 λ(lambda)型 轻链存在于各类免疫球蛋白中 同一个免疫球蛋白分子中的轻链同型
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1、抗原与抗体
抗体的生物学功能——特异性结合抗原 超变区－表位 结合基础 静电力、氢键、范德华力 可逆 影响因素：PH、温度、电解质
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二、免疫沉淀

免疫沉淀反应:(precipitation) 可溶性抗原与相应抗体，在适宜条件下发生结合， 出现的沉淀现象。
液体内沉淀反应
凝胶内沉淀反应 免疫沉淀 免疫电泳技术 免疫浊度技术
絮状沉淀试验 环状沉淀试验 单向扩散试验 试管法 双向扩散试验 平板法
免疫电泳 对流免疫电泳 火箭免疫电泳 免疫固定电泳 透射免疫比浊turbidimetermeasure 散射免疫比浊nephelomitermeasure
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透射免疫比浊法
（transmission turbidimetry 原理
抗原与抗体在一定缓冲液中形成 IC，当光线透过反应溶液时，由 于溶液内IC粒子对光线的反射和 吸收，引起透射光减少，IC越多 透射光越少，可用吸光度表示。
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透射免疫比浊法
反应要求





溶液中形成的复合物分子应足够大(35-100nm) 溶液中形成的复合物分子要足够多 控制抗原抗体反应的温度和时间 加增敏剂，提高复合物形成速度，缩短检测时间 应选择亲和力好、效价高的抗体，保证抗体过量 将标准品稀释至少5个浓度测定，以吸光度值(A) 为纵坐标，浓度为横坐标，在半对数纸上绘出标 准曲线
具有抗体活性或化学结构与抗体分子相似的球蛋白。
抗体一定是球蛋白，球蛋白未必是抗体
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1、抗原与抗体
抗体的分子结构
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1、抗原与抗体
“Y”型，四肽链 重链 （5种: 、 、、、） 轻链 （2种: 、） 可变区 （V区）
超变区（ 又称CDR 互补 决定区）
骨架区: FR
光波
λ
当复合物大于入射光波的1/20时，形成不对称前向散射， 在90o以前的角度测量散射光皆取得最佳效果，散射光 的量代表复合物的量
d
当复合物小于入射波长时呈全透射， 透射与散射相当
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三、免疫比浊技术原理
免疫比浊技术分类：
按光路 透射免疫比浊 散射免疫比浊 终点比浊 速率比浊 无增敏 PEG增敏 胶乳增敏
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2、抗原抗体的结合——免疫学反应


抗原抗体反应的原理
抗原与抗体能够特异性结合是基于两种分子间的结构互补性与亲和 性，这两种特性是由抗原与抗体分子的一级结构决定的。 抗原抗体反应可分为两个阶段。第一为抗原与抗体发生特异性结合 的阶段，此阶段反应快，仅需几秒至几分钟，但不出现可见反应。 第二为可见反应阶段，抗原抗体复合物在环境因素（如电解质、 pH、温度、补体）的影响下，进一步交联和聚集，表现为凝集、 沉淀、溶解、补体结合介导的生物现象等肉眼可见的反应。 抗原抗体的结合使电荷减少或消失，蛋白质由亲水胶体转化为疏水 胶体。 四种分子间引力（电荷引力、范登华引力 、氢键结合力 和疏水作 用 ）参与并促进抗原抗体间的特异性结合。
凝胶内沉淀试验——平板法
原理
将一定量的抗体混入 琼脂凝胶中，使待测抗 原在凝胶中自由扩散，
标准品抗原浓度测定
与相应抗体结合形成沉 淀环，沉淀环大小与抗 原浓度呈正相关。
不同病人抗原浓度测定 PPT课件
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凝胶内沉淀——双向琼脂扩散原理示意图 模拟图
Ag
Ab
1.抗原抗体双向自由扩散 2.24小时出结果 3.呈现沉淀线或弧
按测定时间
按增敏剂
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透射比浊法和散射比浊法光路
透射免疫比浊法是在180°角， 即在直射角度上测定光透射强度。
IC
透射比浊法 I
I0
θ
检测器A
Iθ 检测器B
散射比浊法
PPT课件 散射比浊法在光路的 5°～96°角的方向上测量散射光强度。 37
单色器
透 射 比 浊 计
散射比浊和透射比浊的区别示意图
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1、抗原与抗体
抗体（antibody, Ab）功能性概念 是由抗原刺激而产生并能与刺激其产生的抗原发生 特异性结合的、具有免疫功能的球蛋白。抗体主要存在 血清中，也存在于如呼吸道粘膜液、小肠粘膜液、唾液 以及乳汁等其它体液中。 免疫球蛋白（immunoglobulin, Ig）结构性概念
恒定区 （C区）
铰链区
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1、抗原与抗体
根据重链抗原性的不同，免疫球蛋白可以 分为5类： IgG —γ(gamma) IgA — α(alpha) IgM — μ(mu) IgD — δ(delta) IgE — ε(epsilon)
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1、抗原与抗体
T
致敏T细胞
Ag
B 浆细胞
抗体
PPT课件 抗原性（免疫反应性）示意图
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1、抗原与抗体
完全抗原（complete antigen) 具有免疫原性和抗原 性的物质。
半抗原（hapten，又称不完全抗原 incomplete antigen ） 无免疫原性，只有抗原性的物质。 载体（carrier）赋予半抗原以免疫原性的蛋白质。 半抗原 + 蛋白质（载体） ＝ 完全抗原。
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1、抗原与抗体
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1、抗原与抗体

抗原表位的性质、数目、位置、空间排列和立体构象决 定着抗原-抗体反应的高度特异性。
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1、抗原与抗体
共同表位（common epitope）指不同抗原之间含有的相同或相似的抗 原表位。 交叉反应（cross-reaction）指抗体或致敏淋巴细胞对具有相同或相似 表位的不同抗原均具有的反应（交叉结合）。
检 测时 分间 两 个
在预反应时段， 加小量样本与 抗原/抗体反应， 测定第一次散 射光信号值
加全量样本， 约反应 2分 钟后，第二 次测定散射 光信号
信号峰值 计算机处理 转换为样 品浓度
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定时散射比浊反应曲线图
预反应阶段 5ul样本 反 应 阶 段 45ul样本
信 号
抗原过剩区
抗原不过量 阈值 抗原过量