双键化多黏菌素B1的结构分析及其抗菌活性的初步研究

药研动态
双键化多黏菌素B1的结构分析及其抗菌活性的初步研究
张含智1，孙宁2，刘笑芬3，秦峰4, 1，罗文燕1，黄臻辉5，卞星晨3，丁金国5，刘浩1,*
(1 上海市食品药品检验所，上海 201203；
2 上海科技大学，免疫化学研究所，上海 201203；
3 复旦大学附属华山医院抗生素研究所，上海 200040；
4 复旦大学化学系和生物医学研究所，上海 200438；
5 上海上药第一生化药业有限公司，上海 200240)
摘要：目的双键化多黏菌素B1的制备、结构分析及对其抗菌活性进行初步研究。

方法采用制备色谱对硫酸多黏菌素B 中的双键化组分纯化后通过高效液相色谱-四级杆飞行质谱及核磁技术确证其结构。

测定双键化组分对三种革兰阴性菌包括鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌的最低抑菌浓度，与多黏菌素B1进行比较，评价其抑菌效果。

结果高分辨质谱及核磁数据证明双键化组分的N-端酰基链为反式-6-甲基辛2-烯酰基，命名该组分为2', 3'-脱氢多黏菌素B1。

根据最低抑菌浓度，该组分对三种革兰阴性菌的抑菌活性与多黏菌素B1相当或者较好。

结论本研究确证了2', 3'-脱氢多黏菌素B1的结构并证明该组分具有较好的抑菌活性，为多黏菌素B质量标准的完善和筛选高活性多黏菌素提供了研究基础。

关键词：2', 3'-脱氢多黏菌素B1；高效液相色谱-四级杆飞行质谱；核磁；最低抑菌浓度
中图分类号：R978.1+9 文献标志码：A 文章编号：1001-8751(2020)06-0475-07
Structure Analysis of Vinyl Polymyxin B1 and Preliminary Study on the
Antibacterial Activity
Zhang Han-zhi1, Sun Ning2, Liu Xiao-fen3, Qin Feng4, 1, Luo Wen-yan1, Huang Zhen-hui5,
Bian Xing-chen3, Ding Jin-guo5, Liu Hao1
(1 Shanghai Institute for Food and Drug Control, Shanghai 201203;
2Shanghai Institute of Advanced Immunochemical Studies, ShanghaiTech University, Shanghai 201203;
3Institute of Antibiotics, Huashan Hospital Affiliated to Fudan University, Shanghai 200040 ;
4Department of Chemistry and Institutes of Biomedical Sciences, Fudan University, Shanghai 200438;
5 SPH No.1 Biochemical and Pharmaceutical Co., LTD, Shanghai 200240)
Abstract Objective A preparation and structural analysis method was established for the vinyl polymyxin B1. The antibacterial activity of the new component was also studied. Methods The vinyl polymyxin B1 was purified by preparative chromatography, and its structure was analyzed by HPLC-Q/TOF-MS and NMR. The antibacterial effect of vinyl polymyxin B1 and polymyxin B1 were evaluated by minimum inhibitory concentrations (MIC) of three Gram-negative bacteria, including Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa and Klebsiella pneumoniae. Results The N-terminal fatty acyl of the vinyl polymyxin B1 was confirmed to be trans-6-methyloct-2-enoyl by high resolution mass spectrometry and nuclear magnetic resonance (NMR). The component was named as 2’,3’-dehydro Polymyxin B1 (2’,3’-dehydro PMB1). According to the MICs, 2’,3’-dehydro PMB1 exhibited antimicrobial activity equal or better than PMB1. Conclusion This study confirmed the structure of 2’,3’-dehydro PMB1 and proved that 收稿日期：2020-03-13
基金项目：上海市科学技术委员会科研计划项目(17DZ1910400)；上海市科委项目编号：20142202200；
上海市药品监督管理局课题（YB-2020-04）。

作者简介：张含智，博士，理化检验技术中级，主要从事抗生素药品质量分析与控制研究。

*通信作者：刘浩，博士，主任药师，硕士生导师，研究方向：抗感染药物和微生物药物的分析与质量研究。

多黏菌素B(polymyxin B，PMB)是一类由多黏芽孢杆菌发酵、经非核糖体酶合成产生的多肽类抗生素，对多重耐药革兰阴性菌有很好的临床疗效，被称为抗击超级细菌的“最后一道防线”[1-2]。

而随着PMB的持续使用，也发生了PMB耐药的情况，通过化学合成手段筛选低毒高效的PMB类似物成为一个研究热点[3-5]。

自1947年PMB被首次报道后[6]，对于PMB组分的分离、纯化及结构确证经历了大量的研究工作[7-10]。

目前已对PMB的结构有了统一的认识，主要组分包括PMB1、PMB2、PMB3、PMB1-I、PMB5、PMB6等[10]，PMB组分之间具有较为相似的结构，由N-端脂肪酰基链(FA)、线性三肽及环状七肽组成，组成氨基酸主要包括α,γ-二氨基丁酸(Dab)、苏氨酸(Thr)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)，除Phe外，其他均为L型氨基酸。

而在发酵过程中，因菌种、环境等不同或人为调控会导致产生不同的PMB组分，包括氨基酸被替代、构型发生变化、FA端存在差异的组分，所以在PMB中依然存在未被确定结构的新组分[11]，对新组分的结构确证及抗菌活性研究为低毒高效的PMB类似物筛选提供了思路。

对PMB组分的分离分析方法包括液相色谱法[12-13]、毛细管电泳法[14]；早期通过酸水解或特异性酶水解获取短肽的方法来进行结构的推断[7-8]，随着液质联用技术的广泛应用，可很方便地根据串联质谱[9-11]对肽序列进行确认，核磁技术也被用于辅助判定新组分的结构[15]。

氨基酸构型的分析是在将目标组分制备纯化后，采用水解-衍生化-液质联用的方法进行判断[16]。

FA端的结构除通过质谱数据确定外，也可将PMB水解再经降解反应生成已知结构的脂肪酸进行推断，或者直接与已知结构的脂肪酸比较而得[17]。

基于以上对PMB结构以及结构之间相似性的认识，可在新组分的结构推断中做到省时省力；同时，PMB结构与抗菌活性之间的构效关系被建立起来[18]，研究人员通过修饰PMB的结构获得了一系列更加有效的抑制多重耐药菌的药物[3-5]。

在前期研究中，我们发现了一种新的双键化PMB组分，初步推断双键位于FA端[11]。

本研究中，采用制备色谱对该双键化组分纯化后通过高效液
相色谱-四级杆飞行质谱(HPLC-Q/TOF-MS)及核磁(NMR)技术确证其结构，证明双键化组分的N-端酰基链为反式-6-甲基辛2-烯酰基，命名该组分为2', 3'-
脱氢多黏菌素B1(2', 3'-dehydro PMB1)，结构式见图1所示。

并测定2', 3'-vinyl PMB1对三种革兰阴性菌包括鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌的
最低抑菌浓度(MIC)，与多黏菌素B1进行比较，评
价其抑菌效果。

结果表明，该组分对三种革兰阴性
菌的抑菌活性与多黏菌素B1相当或更好。

本研究为PMB质量标准的完善和筛选高活性PMB提供了研究基础。

1 仪器与试药
Agilent 1290型高效液相色谱仪-6550 QTOF-MS(美国Agilent Technologies公司)；质谱引导的Waters自动纯化系统(沃特世科技(上海)有限公司)；冻干机(美国LABCONCO型真空冻干机)；核磁共振
仪(德国Bruker公司，500 MHz)。

注射用硫酸多黏菌素B(批号：1512801)为上海
上药第一生化药业有限公司提供。

甲酸、三氟乙酸
购自sigma-aldrich，乙腈(色谱纯)购自Merck，其他
试剂均为分析纯，水为超纯水(Milli-Q仪制备)。

鲍
曼不动杆菌ATCC19606(标准菌株)及090342(临床
分离株)、铜绿假单胞菌ATCC27853(标准菌株)及HS231(临床分离株)、肺炎克雷伯菌KP16-0461(临床分离株)均由复旦大学附属华山医院抗生素研究所提
H
2
2
5
6
7
1/3/4/5/8/9：L-Dab，2/10：L-Thr，6：D-Phe，7：L-Leu
图1 2', 3'-脱氢PMB1的结构式
the component had good antibacterial activity. It also provided the research basis for the improvement of the quality standard of polymyxin B and the screening of high activity polymyxin.
Keywords：2’,3’-dehydro Polymyxin B1; HPLC-Q/TOF-MS; NMR; MIC
供。

2 试验方法与结果
2.1 PMB1及2', 3'-dehydro PMB1的制备纯化
精密称取硫酸PMB，溶于乙腈-水(20:80，v :v)中，浓度为10mg/mL。

通过Waters自动纯化系统制备PMB1及2', 3'-dehydro PMB1。

纯化条件如下：选择C18键合硅胶制备柱(19×100mm，5μm)，流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈，流动相A-流动相B=85.2:14.8(v :v)，流速设定为15mL/min，柱压显示为1480psi。

进样量为500μL，紫外吸收波长设定为215nm。

电喷雾质谱选择正离子扫描模式(+ESI)、单四极杆质量分析器(m/z扫描范围设为300-1200)。

质谱补充液为含0.1%甲酸的90%甲醇水溶液，流速为0.45mL/min。

收集2', 3'-dehydro PMB1(m/z 601.4，[M+2H]2+)及PMB1(m/z 602.2，[M+2H]2+)的馏分。

收集200次，分别合并以上两种馏分，经旋转蒸发仪去除溶剂，各加约3~4mL水转移至玻璃瓶中，放入冻干机中冷冻干燥。

冻干机冷肼温度设置为-80℃，真空度设置为0mbar，经24h后，瓶中出现白色片状蓬松状固体，停止冷冻干燥。

由于硫酸多黏菌素B中的2', 3'-dehydro PMB1的含量仅为2.0%(归一化面积法)，且在制备色谱中与相邻组分的分离度较差，需对第一次制备的组分按照如上方法再次纯化，经称量，2', 3'-dehydro PMB1纯化后约16 mg。

PMB1及2', 3'-dehydro PMB1两个制备组分，经HPLC-Q/TOF-MS 分析纯度，分别为98.5%和88.6%。

2.2 HPLC-Q/TOF-MS分析PMB1及2', 3'-dehydro PMB1
精密称量纯化后的PMB1及2', 3'-dehydro PMB1各2mg，加1mL乙腈-水(20:80，v :v)溶解后，经HPLC-Q/TOF-MS进行结构鉴定。

分析条件如下[11]：C18键合硅胶色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流动相采用0.1%三氟乙酸水溶液-乙腈(80:20，v:v)，流速为1mL/min，进样量20μL，检测波长215nm，柱温为50℃；以正离子扫描模式采集一级质谱图和二级质谱图，进样量为5μL，采集范围m/z 50-1700，二级质谱碰撞能量为10-30eV。

2.3 NMR分析PMB1及2', 3'-dehydro PMB1
精密称量纯化后的PMB1及2', 3'-dehydro PMB1各2mg，加氘水溶解后，转移至核磁管中，经核磁共振仪扫描氢谱。

2.4 PMB1及2', 3'-dehydro PMB1的抗菌活性比较
根据临床和实验室标准协会(C l i n i c a l& Laboratory Standards Institute，CLSI)规定，采用微量肉汤稀释法测定PMB1及2', 3'-dehydro PMB1对鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌的MIC值。

分别在96孔板中接种鲍曼不动杆菌ATCC19606(标准菌株)及090342(临床分离株)、铜绿假单胞菌ATCC27853(标准菌株)及HS231(临床分离株)、肺炎克雷伯菌KP16-0461(临床分离株)106 CFU/mL的细菌，并加入PMB1(对照组)或2', 3'-dehydro PMB1的溶液，使溶液终浓度分别为0.125、0.25、0.5、1、2、4、8 mg/L，并于35±2℃下培养18~24h后观测浊度，以溶液澄清的最低浓度为MIC。

3 结果与讨论
3.1 PMB1及2’,3’-dehydro PMB1的质谱结果
我们在前期研究中发现了PMB中的双键组分，并通过高分辨质谱及光化学反应验证了双键位于FA 端[11]。

在本研究中通过质谱引导的纯化系统制备了PMB1及2', 3'-dehydro PMB1两个组分，经HPLC-Q/ TOF-MS分析纯度分别为98.5%和88.6%，两者的总离子流图见图2A及2B所示。

PMB1的准分子离子峰[M+H]+的m/z为1203.7614，[M+Na]+的m/z为1225.7429。

在溶液状态或是在电喷雾过程中，PMB1容易加和两个H+而主要以[M+2H]2+(m/z，602.3848)存在。

以[M+2H]2+为母离子，调整碎裂电压(20eV)得到PMB1的二级质谱图，通过特征离子m/z 963.5745, 863.5117, 762.4638, 662.3994, 482.2919, 361.2243, 241.1925及101.0719，可以推断出多黏菌素B1的氨基酸连接次序[11]。

将以上特征离子与2', 3'-dehydro PMB1的特征离子进行比对，分析结构差异。

2', 3'-dehydro PMB1的准分子离子峰[M+H]+的m/ z为1201.7451(理论分子量m/z为1201.7416)，[M+Na]+的m/z为1223.7270，加和两个质子后的[M+2H]2+为m/ z 601.3771，一级质谱图见图2C。

以[M+2H]2+为母离子，二级质谱图见图2D所示，特征离子为m/z 963.5742, 863.5102, 762.4628, 662.3985, 482.2913, 361.2237, 239.1761及101.0714。

通过一级质谱及二级质谱的信息进行结构判断，与PMB1相比，m/z 239.1761(FA+Dab 的特征离子)比m/z 241.1925小2，推断出2', 3'-dehydro PMB1与PMB1仅在FA端有差异，即FA发生双键化。

3.2 PMB1及2', 3'-dehydro PMB1的NMR结果
PMB1的氢谱见图3A所示，氢归属如下所示：1H NMR (500 MHz, D
2
O) δ 8.42 (s, 2H), 7.41 (t, J = 7.2
Hz, 2H), 7.38 – 7.34 (m, 1H), 7.28 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 4.53 (d, J = 7.7 Hz, 4H), 4.37 (s, 1H), 4.31-4.26 (m, 5H), 4.19 (d, J = 3.1 Hz, 2H), 3.42 – 3.35 (m, 1H), 3.22 – 3.01 (m, 12H), 2.98 – 2.85 (m, 2H), 2.31-2.26 (m, 8H), 2.16 – 2.05 (m, 3H), 2.01-1.97 (m, 2H), 1.90 (s, 1H), 1.60 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 1.49 (s, 1H), 1.37-1.33 (m, 6H), 1.22 (d, J = 6.1 Hz, 6H), 1.13 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 0.84 (t, J = 6.4 Hz, 6H), 0.74 (s, 3H), 0.67 (s, 3H)。

2', 3'-dehydro PMB1的氢谱见图3B 所示，氢归属如下所示：1H NMR (500 MHz, D 2O) δ 8.46 (s, 2H), 7.41 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 7.36 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 7.28 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 6.91 (J = 15.4, 7.6 Hz, 1H), 6.05 (d, J = 15.4 Hz, 1H), 4.58 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.51 (d, J = 4.6 Hz, 2H), 4.37 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 4.33 – 4.25 (m, 5H), 4.20 (d, J = 4.3 Hz, 2H), 3.38-3.33 (m, 1H), 3.11 (d, J = 7.1 Hz, 12H), 2.95 – 2.88 (m, 1H), 2.88 – 2.79 (m, 1H), 2.28 – 2.22 (m, 6H), 2.13 – 2.06 (m, 3H), 2.01 – 1.95 (m, 2H), 1.89 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 1.58-1.54 (m, 3H), 1.40 (s, 4H), 1.21 (d, J = 6.2 Hz, 6H), 1.19-1.13 (m, 2H), 0.89-0.85 (m, 6H), 0.77 (s, 3H), 0.70 (s, 3H)。

对比两者的氢谱，差别主要在化学位移6-7之
间。

化学位移6.05(d, J = 15.4 Hz, 1H)及6.91(dt, J = 15.4, 7.6 Hz, 1H)为双键(2’氢与3’氢)的特征峰，且由于顺式双键的耦合常数大概在10.9左右，从2', 3'-dehydro PMB1的耦合常数J = 15.4 Hz 推断为反式双键。

由于与羰基形成共轭双键，双键氢的化学位移会移向6-7，如果是非共轭双键则化学位移在5-6范围内，因此，从较低场的化学位移判断双键与羰基形成共轭结构，即在2'、3'碳之间形成双键。

这种反式双键与羰基的共轭结构同样存在于黏菌素(Colistin)中[19]，即组分2', 3'-dehydro PME1。

确定双键位置后，进一步研究2', 3'-dehydro PMB1的二级质谱图，发现共轭结构会活化脂肪链，在碰撞电压(20eV)下可以裂解出更多低质量数(m/z 50-250)的特征离子，见图4所示。

推测的裂解途径见图5，特征离子m/z 239.1761(即FA+Dab)失去Dab 酰基正离子后得到m/z 139.1122，继续失去一份子CO 得到m/z 111.1172，双键转移同时发生[1,6]氢迁移生成异戊烯基正离子即m/z 69.0703。

本研究修正了文献
[11]
中提出的双键化PMB 组分的结构。

3.3 PMB1及2', 3'-dehydro PMB1的抗菌效果
PMB1及2', 3'-dehydro PMB1对三种革兰阴性菌：
A ：纯化后PMB1的TIC 图；
B ：2', 3'-dehydro PMB1的TI
C 图；C ：一级质谱；
D ：二级质谱图
图2 PMB1及2’,3’-dehydro PMB1的质谱结果
I n t e n s i t y (E 6)
I n t e n s i t y (E 6)
I n t e n s i t y (E 6)
I n t e n s i t y (E 5)
1.8
2.52.01.51.00.50.0
C
D 300
200
600
400
900600
1200800
1500
1000
1201.7451
1223.7270
601.3771
m/z
m/z
T (min)
T (min)
202030
3040
40
10
10
012121.51093
61.280.960.640.320.0
0239.1761
601.3771
PMB 12',3'-dehydro PMB1
A
B
482.2913361.2237762.4628
963.5742
A:纯化后PMB1；B ：2', 3'-dehydro PMB1
图3 PMB1及2', 3'-dehydro PMB1的NMR 结果
2500010000
14000
13000
12000
11000
10000
9000
800070006000500040003000200010000-1000
2400023000220002100020000190001800017000160001500014000130001200011000100009000800070006000500040003000200010000-1000-2000
0.0
0.0
0.50.51.0
1.0
1.51.5
2.02.02.52.5
3.03.03.53.5
4.04.0
4.54.5
5.05.05.55.5f1(ppm)
f1(ppm)
2.03
2.098.468.42
7.427.417.397.377.367.357.297.27
4.794.544.524.374.314.294.284.274.194.193.373.163.153.123.123.113.063.042.342.332.262.242.231.611.591.491.391.371.311.231.221.131.120.860.840.830.740.67
7.427.417.397.377.367.297.276.946.926.916.886.88
6.076.044.794.574.524.514.374.364.314.304.294.284.274.264.214.203.383.363.353.123.112.922.842.832.262.252.232.122.111.491.401.301.221.210.880.860.850.840.770.70
2.311.231.922.221.000.97
1.94
1.00
1.99
2.341.025.215.044.072.23
1.071.241.99
2.250.981.081.91
12.001.30
3.206.293.282.881.982.450.891.142.002.821.01
4.136.176.276.082.111.976.406.013.163.033.08
3.26
6.0
6.0
6.5
6.5
7.07.0
7.5
7.5
8.0
8.0
8.5
8.5
9.0
9.0
9.5
9.510.5
10.5
A
B
鲍曼不动杆菌(ATCC19606(标准菌株)及090342(临床分离株))、铜绿假单胞菌(ATCC27853(标准菌株)及HS231(临床分离株))、肺炎克雷伯菌(KP16-0461)的MIC 值见表1所示。

从结果表明，2', 3'-dehydro PMB1对以上三种革兰阴性菌的标准菌株及临床分离株均具有抗菌活性，且对鲍曼不动杆菌的MIC 值较PMB1的低一个稀释度(该方法误差允许范围为1个稀释度)，说明2', 3'-dehydro PMB1的抗菌活性与PMB1相当或者较好。

4 结论
本研究通过高分辨质谱及核磁数据分析了
2', 3'-dehydro PMB1的结构，同时初步确证了2', 3'-dehydro PMB1对革兰阴性菌具有抗菌活性。

建议在药典标准中将2', 3’-dehydro PMB1作为有效组分进行控制，同时本研究为双键化PMB 结构类似物的药物研发开拓了思路。

参 考 文 献
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[4] 崔阿龙, 胡辛欣, 高岩, 等. 新型多黏菌素B 衍生物的设计
合成及生物功能研究[J]. 药学学报, 2019, 54(11): 2031–2038.
表1 PMB 1与2', 3'-dehydro PMB1对革兰阴性菌的抗菌活性(MIC)
化合物 鲍曼不动杆菌MIC (mg/L) 铜绿假单胞菌MIC (mg/L) 肺炎克雷伯菌MIC (mg/L)ATCC19606090342ATCC27853HS231KP16-0461PMB1
111212', 3'-dehydro PMB1
0.5
0.5
1
2
2
m/z
239.1761m/z 139.1122_
m/z 69.0703
m/z
111.1172
图5 2', 3'-dehydro PMB1的特征离子(FA+Dab)的可能裂解规律图[5] Ma S, Wang MH, Hong YZ, et al . Polymyxin derivatives as
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说明：m/z 50-250
图4 2', 3'-dehydro PMB1在低质量范围的MS/MS 图
101.071469.070350
100
150200
250111.1172
139.1122m/z
I n t e n s i t y (E 5)
239.1761
2.52.01.51.0
0.5
0.0
liquid chromatography coupled to mass spectrometry[J].
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