药物的免疫原性分析方法浅析

药物的免疫原性分析方法浅析
摘要：药物的免疫原性评价是临床安全性评价的重要组成部分，药物引起的
抗体反应会影响药动学、药效或毒性反应。

ADA的产生会缩短或延长药物半衰期，改变药物在体内的生物分布。

免疫原性的分析在复杂的血清基质中进行，涉及到
多学科多领域。

分析方法及检测水平也存在不一致的情况，需要规范实验操作，
提高检测的有效性。

免疫原性评价是药物开发阶段中安全与疗效评价的需要，也
是申报提交的关键要素。

开发有效的免疫原性检测方法意义重大。

关键词：免疫原性，MRD，方法学验证
正文
免疫原性通常是指治疗性蛋白和/或代谢物诱发其自身或相关蛋白的免疫应
答或免疫相关事件的能力。

一般分子量越大免疫反应越强。

分子量低于4000时
一般不具有免疫原性，在4000到10000之间时具有弱免疫原性，分子量大于10000时具有强免疫原性。

但是也有例外要根据物质的结构决定。

免疫原性分析
必须在临床前和临床阶段均开展。

具有免疫原性的物质可能诱发机体产生有害的
免疫反应，甚至威胁生命。

免疫原性评价需要有效特异的检测方法。

在临床前便需要确定检测方式，在
方法的设计、开发和验证中需要严格控制各环节。

临床前和临床中样本的检测需
使用经过严格验证的方法进行检验。

目前应用较广泛的是平台主要包括ELISA、ECL、RIA和SPR。

检测方法一般为夹心法、间接法或直接法。

免疫原性方法学的开发要考虑多种因素，主要包括反应模式的选择、包
被抗原浓度的选择、包被条件的选择、封闭条件的选择、样品稀释液的选择、最
小稀释度（MRD）的选择、酶稀释液的选择、显色液时间的选择以及各条件的孵
育时间及温度的选择。

每个反应步骤都会影响方法的性能。

阳性抗体的质量直接
影响方法的灵敏度。

阳性抗体需要稀释在与待检样本一致的空白动物血清中。

由
于基质的复杂性，在很大程度上会增加检测背景，需要优化各反应条件将背景降
低。

对于背景的高低无确定的要求，但是背景越低越好，太高的背景也会影响检
测灵敏度。

开发过程中要优先考虑灵敏度和耐药性，其次为精密度、选择性、特
异性、稳定性。

图1 免疫原性多层级检测策略示意图
免疫原性分析一般需要分四个部分进行，筛选实验、确证实验、滴度实验以
及中和活性实验。

在筛选实验中要尽可能的检测出阳性样本，所以允许假阳性率
为5%。

筛选实验确定的阳性样本进行确证实验证明抗体的特异性，确证实验允许
假阳性率为1%。

确证为阳性的样本通过连续稀释确定其最终的滴度。

确定为阳性
的样本还需要通过中和实验确定否存在中和活性抗体。

开发的方法学一般要求既
有良好的灵敏度又有较小的个体差异，需要通过优化各种条件达到两者之间的平衡。

方法学验证过程中至少包含灵敏度、精密度、选择性、药物耐受性、特异性、稳定性的验证数据。

具体测试方式及合格标准如下：
1、灵敏度
方法灵敏度是指阳性对照样品检测结果持续为阳性或读数等于该检测方法临
界值的最低浓度。

在灵敏度考察中对于IgG，非临床研究灵敏度需要达到250-
500ng/ml,临床研究灵敏度要达到100ng/ml[1]。

对于方法开发中，一般会选择亲
和力较高的阳性抗体，这样可能和样本中的抗体亲和力水平不一致，而高估了检
测的灵敏度。

免疫原性试剂盒不可以定量检测待测物质的含量，但是可以更全面
的了解检测方法的性能。

阳性抗体系列稀释在空白基质中，稀释倍数要小于3倍，至少包含5个浓度，高于筛选临界值的点即为方法学灵敏度。

IgE型抗药抗体的
灵敏度检测需要达到几百pg/ml或几ng/ml级别。

对于中和活性抗体的检测可能无法达到该灵敏度水平。

2、MRD
MRD的选择一般为1：5到1：100，样本稀释后可减少非特异物质的含量，但是不要超过1：100，稀释比例太低会影响方法的灵敏度而出现假阴性样本。

至少采用10个个体血进行测试。

以个体差异较小，灵敏度合格为宜。

3、筛选临界值
筛选临界值的确定，对于非临床样本建议采用至少15个样本，临床样本采用不少于50个样本进行筛选临界值的确定。

非临床研究中，筛选临界值应由至少2名分析员在至少3天内进行3个分析批的测试。

临床研究应由至少2名分析员在至少3天进行6个分析批的测试。

一般为复孔测试，加入标准曲线及个体空白血清样本，按照实验条件完成实验后，获得各点的信号值。

筛选临界值的计算方式为将样本复孔取均值，计算个体样本均值的标准偏差和均值，通过
SCP=SNR+1.645×SD计算灵敏度[2-7]。

对于非临床研究，如果阳性抗体配置的标准曲线灵敏度达到500ng/ml，但是个体样本计算的Cutpoint信号高于500ng/ml对应的信号值，试剂盒的灵敏度也不符合要求。

4、确证临界值
确证临界值的确定，需要将特定浓度的受试药物加入不同空白基质中，通过计算信号抑制率来计算，CCP=%SIR+2.326×SD。

对于非临床样本采用至少15个样本，临床样本采用不少于50个样本进行确证临界值的确定。

非临床研究中，CCP应由至少2名分析员在至少3天内进行3个分析批的测试。

临床研究应由至少2名分析员在至少3天进行6个分析批的测试。

5、精密度
方法学精密度的好坏直接关系到检测的准确性和可重复性。

精密度一般要求由不同的分析人员，在相同仪器或平台进行检测，分为批内精密度和批间精密度。

临床分析中至少需要测试6个分析批，非临床研究至少需要3个分析批。

精密度的评价一般采用6套独立配置的质控品进行数据分析。

质控样本需要包括阴性对照、低浓度阳性质控、中浓度阳性质控、高浓度阳性质控及确证实验的免疫耗竭对照。

各样品设置复孔。

对于非临床研究，可以在各分析批设置一套标准曲线和3套独立配置的质控样品。

分析过程中各分析批计算批内精密度，以及3批之间的批间精密度。

批间精密度计算时将分析批各质控品取均值，再计算各均值的均值及标准偏差，从而计算批间精密度。

批内精密度和批间精密度均应低于20%，对于NC可以放宽标准。

精密度的计算公式为CV=SD/均值。

6、特异性
特异性的测试用于评价开发方法检测目标分析物的专一性，要证明检测的是受试药物的特异性抗体，而非结构类似物或基质中的其它干扰物质。

通过向空白基质中加入不同浓度的干扰物质，证明方法的特异性。

考察指标不限于血清因子、脂质、血红蛋白、以及其它结构类似物[8-12]。

在开发初期就需要测试原材料的特异性。

为了验证试剂盒对于目标抗原的特异性，通过在阳性抗体配置的样本中加入待测抗原，信号有明显降低来证明。

此实验需要在阴性对照及低浓度质控品中测试，对加入抗原和不加抗原的样本进行比较说明试剂盒的特异性。

7、选择性
选择性是确定分析方法能够在样本中存在其它成分的情况下检出特异性针对该药物的抗药抗体的能力。

由于检测样本的复杂性可能会存在干扰物质。

测试时一般选用至少10个样本，分别对空白个体样本和各阴性样本中加入低浓度阳性对照考察。

确保至少80%样本符合标准。

至少80%的空白样本检测小于筛选临界值，至少80%的低浓度阳性对照高于筛选临界值。

8、耐药性
耐药性的考察也非常重要。

ADA的检测往往是在样本中含有一定数量的抗原中检测的。

ADA与抗原结合可能会影响ADA的检测。

所以在工艺确定后需要尽快考察药物的影响。

一般通过在低浓度阳性对照抗体中加入不同浓度的药物进行考察，随着药物浓度的增加，信号降低,响应值高于筛选临界值所对应的最高受试药物浓度即为该浓度阳性对照抗体能够耐受的最大药物浓度。

由于阳性对照抗
体样品与待测样本中ADA的亲和力存在差异，所以测试的耐药性结果可能会与真
实样本存在差异。

耐药性越高越好。

可以通过酸解提高方法的耐药性，如果耐药
性较低时可以在标本采集时加以注意，可通过采集受试者体内药物钠浓度达到谷
浓度时的样本来尽量降低药物的干扰。

9、稳定性
稳定性，在方法学开发中需考察样品的冻融稳定性、室温稳定性、保存
稳定性，除此之外还需考虑使用的试剂盒的稳定性。

冻融稳定性可以根据实验需
要测试冻融次数，可根据实验确定需要测试的冻融次数。

一般每个循环可以采用
冷冻过夜，溶解2小时方式。

在实验操作过程中样本会置于室温一段时间，从低
温转移到室温环境条件后，样本的稳定性可能会受到影响。

一般情况下需测试样
本在室温放置1天、2天的稳定性。

对于生物基质样本一般需放置于-20℃或-80℃，但是由于生物基质的复杂性，对于不同项目需要分别考察。

开发的试剂盒
的稳定性会影响检测样本的准确性，所以试剂盒稳定性很重要，如果条件允许可
进行加速稳定性和长期稳定性[13-15]。

稳定性考察的样本与对照差异需小于±20%。

10、HOOK效应
由于抗原或抗体过量有可能会存在钩状效应，样本含量高反而被检测为
阴性。

此类现象一般出现在一步法实验中。

对于两步法的实验操作，理论上不会
出现Hook效应。

非临床研究和临床研究中，应考察是否存在钩状效应。

小结及展望
免疫原性的存在不仅关系到药物治疗效果，更会危害到患者的生命安全，在
药品上市之前及上市后均需要严格监测免疫原性对受试者的影响。

开发可靠的检
测方法不仅可以确保测试数据的可靠性，还可以推动药物的研发进程。

参考文献：
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[2] Bioanalytical method FDA
[3] Guieline on bioanalytical method validation Feb-2012.EMA
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