实验三 PCR-荧光探针法鉴定转基因大豆

实时荧光定量PCR Quantitative Real-Time PCR
（一）Real-time qPCR原理
实时定量PCR原理
• 实时定量PCR技术（real-time quantitative PCR） 是指在PCR反应体系中加入荧光染料，实时监测 荧光染料 整个PCR过程中荧光信号的累积强度，并利用特定 数学原理对未知模板进行定量分析的方法。
基因组DNA分离纯化中的注意事项
保证基因组DNA的完整性和纯度 提高DNA的洗脱效率 DNA的储存
（二）转基因大豆鉴定 — CaMV35S基因核酸检测试剂盒杂交试剂盒
• 采用实时荧光PCR技术，针对CaMV35S基因核 酸序列设计特异性引物和荧光探针，通过实 时荧光PCR（Taqman探针法）对转基因成分 CaMV35S基因进行检测。
特异性高 多重PCR检出
要求反应的特异性 不能进行多重PCR
Probe设计要求高 Probe合成费用高
常用于mRNA表达量分析等
常用于SNP解析，病毒、病原菌检测
（三）Real-Time qPCR主要概念
非探针 扩增曲线
化学原理
实时定量PCR
两个重要图形
探针
熔解曲线
Real-Time qPCR曲线的意义
106 105 104 103 102 10
荧光强度---循环数曲线
初始模板量对数---C(T)循环数标准曲线
三、实验内容
• 大豆DNA提取 • PCR-荧光探针法检测CaMV35S基因
四、实验材料和用品
大豆 大豆DNA提取试剂盒 CaMV35S基因核酸检测试剂盒 仪器：荧光定量PCR仪 台式离心机等
DePure Plant DNA Kit 基于硅胶 柱纯化方式。样品经液氮或研磨仪匀 浆后，在裂解液中裂解，DNA 释放到 裂解液中。经高盐溶液沉淀去除多糖 等杂质后，加入乙醇，转移至柱子中 过滤，DNA 被吸附到柱子的膜上，而 蛋白质则不被吸附而去除。柱子经 Buffer GW2 洗涤去除盐分，最后 DNA 经 Buffer AE洗脱。
2.荧光阈值
• 一般把荧光PCR的前15个循环信号作为荧光本底信号 （baseline，基线期），即样本的荧光背景值和阴 性对照的荧光值，扩增的荧光信号被荧光背景信号 所掩盖。 • 是人为设定的一个值，可设在指数扩增阶段任意位 置上。 • 缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍（自动）。
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Ct值
• Ct值与模版的拷贝数存在着线性关系，起始拷 贝数越多，达到阈值所需的循环数就越少，Ct 值也就越小，反之亦然。 • 正常的Ct值范围在18-30之间，过大和过小都 将影响实验数据的精度。
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C(t)与初始模板含量
• 初始模板量越多，C(t)值越小
C(t)与初始模板浓度的对数值成线性关系
Taqman probe 的工作原理
探针与PCR产物的数量关系
• 每产生一个新的DNA片段，就切断一条探针 • 每切断一条探针，就产生一个单位的荧光信 号 • 信号强度与DNA的copy数成正比
SYBR Green I 法与Probe法比较
SYBR Green I 法 简便易行 价格便宜
One-Step RT-PCR Probe法
扩增曲线
熔解曲线
图片为：首都医科大学演示实验结果 材料：小 鼠肝脏 基因：β-actin
1.扩增曲线
• 描述PCR动态进程的曲线称为扩增曲线。 • PCR的扩增曲线实际上并不是一条标准的指数曲线， 而是呈S型曲线
Fluoresces
Cycles
扩增曲线
• 扩增曲线分三个阶段：
• 荧光背景信号阶段(基线期)：扩增的荧光信号被荧光背景信 号所掩盖，无法判断产物量的变化。 • 荧光信号指数扩增阶段（对数期），PCR产物量的对数值与起 荧光信号指数扩增阶段（对数期） 始模板量之间存在线性关系，可选择该阶段进行定量分析。 • 在平台期：扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量 在平台期： 与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量 不能计算出起始DNA拷贝数。
试剂盒组成
需要准备的材料和工具
无水乙醇(96%-100%) 65℃水浴锅/金属浴 灭菌的离心管和枪头 小型离心机(13,000 x g) β-疏基乙醇 按瓶子标签所示，加入 2 倍体积的无水乙醇稀释 Buffer PBD，并于室温保存。
方
法
1. 称20 mg 大豆样品于 1.5 ml 离心管中。 2. 立即加入 400µl Buffer ATL（2-Me）和 5µl RNase Solution，最高速度涡旋使样品 充分分散。65℃处理30-40分钟，水浴期间涡 旋混匀 2 次。 可选:使用前可在 1ml Buffer ATL 加入 20µl 2-疏基乙醇，提高裂解液抗氧化的能力，防 止多酚氧化而降低 DNA 产量。
试剂盒组成
组分名称 反应液（CaMV35S-S） 阳性对照（CaMV35S-S） 阴性对照 规格×数量 500 μL×1支 50 μL×1支 50 μL×1支
需要准备的材ห้องสมุดไป่ตู้和工具
1）灭菌1.5 mL或2.0 mL带旋盖的离心管； 2）灭菌0.2 mL PCR管及枪头； 3）碎冰或冰盒； 4）微量移液器（0.5～10 μL，10～100 μL，100～1000 μL ）； 5）离心机； 6）涡旋振荡器； 7）金属浴； 8）均质机、搅拌机或研钵等研磨器具； 9）电子天平。 10）【适用仪器】 荧光PCR仪ABI 7500、LightCycler480、CFX 96、Mx 3005P等。
荧光阈值
• 手动设置，原则：大于样本的荧光背景值和阴性对照 的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶 段，真正的信号是超过域值的荧光信号。
3. Ct值
• Cycle threshold，就是当扩增产物的荧光信号达到设 定的阈值时所经过的循环次数。
Ct值
Ct值
线性图谱
半对数图谱
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Ct值的重现性
3. 加入 140µl Buffer PS 至样品中，涡旋 30 秒混匀。冰上放置 10 分钟。 4. 13,000 × g 离心 5 分钟。小心转移 400µl 上清液至新的离心管中。 5. 加入 600µl Buffer PBD(已用无水乙醇稀释 )至样品中，涡旋混匀 30 秒。若出现明显的 絮状沉淀，用移液枪吸打尽量打散沉淀。 若 上清液体积不够 400µl，按比例调整 Buffer PBD 的用量。Buffer PBD 在使用之前，必须 加入 2 倍体积的无水乙醇进行稀释。
实验三 PCR-荧光探针法鉴定转基因大豆
一、目的要求 通过转基因植物（大豆）的鉴定，了 解并掌握PCR-荧光探针法的原理和方 法。 应用荧光定量PCR仪进行基因的鉴定。
二、实验原理
采用实时荧光PCR技术，针对CaMV35S基 因核酸序列设计特异性引物和荧光探针， 通过实时荧光PCR（Taqman探针法）对 转基因成分CaMV35S基因进行定性检测。
五、实验方法和步骤 （一）大豆DNA提取 • 采用CTAB裂解法提取植物DNA。 • CTAB可以将植物细胞充分裂解，并释放出基 因组DNA，再将细胞裂解物转移到纯化柱中离 心纯化。 • 在高盐状态下，纯化柱中的硅胶膜专一性地 吸附DNA，然后用漂洗液洗涤掉残留在硅胶膜 上的杂质和高浓度盐离子，最后在低盐或水 溶液状态下，DNA很容易被洗脱下来。 • 洗脱下来的DNA可作为PCR扩增的模板。
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六、结果和分析
1.检测样品无Ct值，曲线为直线或轻微斜线， 无“S”型扩增曲线，可报告样品阴性，不含 有CaMV35S基因或含量低于检测限； 2.检测样品Ct≤36，曲线呈“S”型扩增曲线， 可直接报告样品阳性，含有CaMV35S基因； 3.检测样品36＜Ct≤40，需进行一次重复实验， 若Ct值仍处于36和40之间且呈“S”型扩增曲 线，同时阴性对照无Ct值，报告样品阳性， 否则报告样品阴性。
DePure 硅胶柱是采用高结合力的玻璃纤维 滤膜为基质。滤膜在高浓度离子化剂(如盐酸 胍或异硫氰酸胍)条件下，可通过氢键和静电 吸附核酸，而蛋白质或其它杂质不被吸附而去 除。吸附了核酸的滤膜经洗涤液洗涤去除蛋白 质和盐，最后用低盐缓冲液(如 Buffer AE 等 )洗脱滤膜上吸附的核酸，所得到的核酸纯度 高，可直接用于各种下游实验。
6. 把 DNA 结合柱装在 2ml 收集管。转移一 半体积的混合液至柱子中。8,000 × g 离 心 30-60 秒。 7. 倒弃滤液把柱子装回收集管。转移剩余的 混合液至柱子中。8,000 × g 离心 30-60 秒。 8. 倒弃滤液把柱子装回收集管。加入 600µl Buffer GW2(已用乙醇稀释)至柱子中。 8,000×g 离心 60 秒。 注：Buffer GW2 须用无水乙醇稀释，按瓶子 标签或说明书指示进行稀释。
注意事项
1．试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰上操作。 2．试剂配制建议在试剂配制区进行，样品处理要求在超净工作 台内操作。实验过程中穿工作服，带一次性手套，使用自卸管 移液器，反应液的配制、分装请一定使用新的 (无污染的) 枪 头、离心管等，尽量避免污染。 3．反应液中的成分对光敏感，应避光保存。反复冻融可能降低 试剂盒灵敏度，请按检测频次将反应液以适当体积分管保存。 4．试剂使用前要完全解冻，推荐使用前涡旋混匀，10000 rpm离 心10秒。
（二）Real Time PCR的检测方法
SYBR Green I
荧光染料嵌合法 荧光探针法
TaqMan Probe
Cycling Probe
Molecular Beacon
etc.
1. 荧光染料法
SYBR Green I 的最大吸收波长约为497nm，发射 波长最大约为520nm
2. 荧光探针法(Taqman)
实验方法
1.试剂配制 在冰上解冻反应试剂，反应液解冻时应 保持避光。反应试剂解冻后振荡混匀数秒， 10,000 rpm离心数秒。 按每管20 μL加至PCR管中。 2．样品前处理 固态试样：待检测的固体试样研磨成颗 粒状，颗粒的大小在2mm以下。 3．DNA的提取与纯化
4.加样 在上述含有反应液的PCR管中加入5 μL模板（加样 顺序为阴性对照、待检样品、阳性对照），盖好管盖， 10000 rpm离心30 s，立即进行PCR扩增反应。 5. 扩增反应（在扩增区进行） 将PCR管放置在实时荧光PCR仪中，荧光基团选择 FAM，淬灭基团选择TAMRA，按照下面的循环条件运行。
结果分析
1．实验室环境污染，试剂污染，样品交叉污染 会出现假阳性结果，如阴性对照检测为阳性 ，则需做进一步实验来确认是哪类污染。如 为试剂污染，需开封新的试剂盒再次进行实 验；如为样品交叉污染，应重复实验；如为 实验室环境污染，需对实验室进行彻底清洁 或更换实验室再进行实验。 2．试剂运输、保存或配置不当会引起试剂检测 性能下降，出现假阴性结果。如阳性对照检 测为阴性或Ct值大于30，应开封新的试剂盒 再进行实验。
9.倒弃滤液把柱子装回收集管。加入 600µl
Buffer GW2(已用乙醇稀释)至柱子中，8,000× g 离心 60 秒。 10.倒弃滤液把柱子装回收集管。13,000 × g 离 心 2 分钟去除柱子中残留的乙醇。 11.将柱子转移至新的 1.5ml 离心管中。加入 15-50µl 预热到 65℃ 的 Buffer AE 至柱子的 膜中央，室温静置 2 分钟。13,000 × g 离心 1 分钟。 12.再加入 15 - 50µl 预热到 65℃ 的 Buffer AE 至柱子的膜中央，室温静置 2 分钟。 13,000 × g 离心 1 分钟。 13.丢弃 DNA 结合柱，DNA 保存于-20℃或-80℃ 。
PCR循环 95℃ 95℃ 60℃
荧光收集位点 10分钟 15秒 1分钟 1个循环 40个循环 — — ※
6．基线和阈值设定 基线调整取3-15个循环的荧光信号，阈值线应超过 阴性对照扩增曲线的最高点。 7．质量控制 —— 阴性对照：无Ct值，曲线为直线或轻微斜线， 无“S”型扩增曲线； —— 阳性对照：Ct≤30，呈“S”型扩增曲线。