体外合成朊病毒的研究进展

华东师范大学马继延课题组将含有单链rna磷脂和重组prp以及种子prpsc的混合物采用rprppmca方法使得正常rprp转化为rprpres经过鼠生物学分析证明新生成的rprpres可以导致小鼠患病19从此克服了以前rprppmca转化产物无传染性的缺而且转化底物是大肠杆菌表达的rprp相对于从动物组织中纯化而来的prp更为简便易得克服了pmca技术的转化底物不容易获得的缺点
验中并不能传播疾病。与直接混合的方式相比， 无细 胞转化分析在转化效率上有了很大的提高， 然而没有 获得具有传染性的 Ｐ ｒ Ｐ ， 并不适合作为体外合成系统。 ｒ ｅ ｓ
有相同的糖基化形式， 一样的电泳迁移率， 一样的蛋白
ｓ ｃ 酶抗性等。最初种子 Ｐ ｒ Ｐ 经过正常脑匀浆的连续稀
释， 其终浓度远低于可以感染小鼠的剂量， 鼠生物学分
２ ０ １ ０ ， ３ ０ （ １ ０ ）
刘 东 等： 体外合成朊病毒的研究进展
７ ５
２ ］ 病症状 ［ 。实验结果都显示转化效率为零。尽管尝试
所有实验要求的体外合成系统。
没有获得任何结果， 但是他们极具新意的想法为后来 的研究者开辟了一个新的领域。
４ 蛋白质错折叠循环扩增
９ ］ ｃ Ｓ ｏ ｂ ｏ ｒ ｉ ｏ 等［ 以循环超声波脉冲处理大量的 Ｐ ｒ Ｐ ， ｃ ｓ ｃ 将正常 Ｐ ｒ Ｐ 转化为具有传染性的 Ｐ ｒ Ｐ 。他们将这个
８ ］ Ｓ ａ ｂ ｏ ｒ ｉ ｏ等 ［ 提出 “ 细胞裂解液转化分析（ Ｃ ｅ ｌ ｌ
ｌ ｙ ｓ ａ ｔ ｅｃ ｏ ｎ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｏ ｎａ ｓ ｓ ａ ｙ ） ” 系统， 这种方法主要是将中国
ｃ 仓鼠卵巢细胞裂解， 实验测定其中 Ｍ Ｈ Ｍ ２Ｐ ｒ Ｐ 的含量，
较好地模拟 Ｐ ｒ ｉ ｏ ｎ 的形成过程。 与以往方法相比， Ｐ Ｍ Ｃ Ａ技术在体外产生 Ｐ ｒ ｉ ｏ ｎ方 面具有很大优势， 其缺点也很明显。Ｐ Ｍ Ｃ Ａ与无细胞转 化分析一样， 都需要存在于脑匀浆中的某种物质帮助。
。如 Ｋ ｉ ｒ ｄ ｙ 等
［ ７ ］
用大肠杆菌表达的重组 Ｐ ｒ Ｐ 在盐
ｃ ｓ ｃ
ｒ Ｐ向ｐ ｒ ｐ 的转化。无细胞 酸胍存在的条件下完成了 Ｐ ｒ ｅ ｓ ｒ Ｐ 的浓度 转化分析存在很多不足， 比如实验中需要 Ｐ
ｃ ｒ Ｐ ５ ０倍； 加入的化学物质剂量过高， 明显与体 要高于 Ｐ ｓ ｃ 内环境不符； 通过这种方式产生的 ｅ ｙ 等开发了第一种可行的 Ｐ ｒ Ｐ 体外合成方 ｒ ｅ ｓ 法， 并命名为“ 无细胞转化分析（ ｃ ｅ ｌ ｌ ｆ ｒ ｅ ｅｃ ｏ ｎ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｏ ｎ ） ” 。他 们 将 从 病 鼠 脑 中 提 取 的 Ｐ ｒ Ｐ 用盐酸胍 ａ ｓ ｓ ａ ｙ ３ ７ ℃ 处理 ５ｈ ， 再与鼠成纤维细胞表达的 Ｐ ｒ Ｐ在ｐ Ｈ ７含 有盐酸胍、 Ｎ ａ Ｃ ｌ 、 Ｔ ｒ ｉ ｓ Ｈ Ｃ ｌ 的转化溶液中混合，２ ０ ℃孵
ｓ ｃ ０ ０倍， 比以前方法所需的 Ｐ ｒ Ｐ 大为减少。最初的 的１
实验方案是将混合物在 ３ ７ ℃ 孵育 １ｈ ， 期间进行 ５次 ） 超声波脉冲， 目的是将形成的聚集体打散， （ 每次 １ｓ
ｓ ｃ ｒ Ｐ 聚集体， 以提高转化效率。通过鉴 再形成更多的 Ｐ ｓ ｃ 定每次循环产物， 表明新产生 Ｐ ｒ Ｐ 的量与循环次数成
表明细胞裂解液中存在可以促进转化的未知物质。这 ｒ Ｐ 较少， 本 个系统与无细胞转化分析相比只是所需 Ｐ 质上并没有太大的改变， 同样存在转化效率低且没有 合成出具有传染性的 Ｐ ｒ Ｐ 的缺点， 也不适合作为满足 ｒ ｅ ｓ
ｃ ［ ３ ］ 育２ ２ｈ ， 约有 １ ０ ％～ ２ ０ ％的 Ｐ ｒ Ｐ 转变为 Ｐ ｒ Ｐ 在体 ｒ ｅ ｓ ， ｃ ｃ ｓ ｃ
Ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎｍ ｉ ｓ ｆ ｏ ｌ ｄ ｉ ｎ ｇ 系统命名为“ 蛋白质错折叠循环扩增（ ｃ ｙ ｃ ｌ ｉ ｃａ ｍ ｐ ｌ ｉ ｆ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ） ” ， 简称 Ｐ Ｍ Ｃ Ａ 。这个系统主要包括 患病鼠脑匀浆和正常鼠脑匀浆的混合物， 超声波仪和 温控孵育器。其中正常脑匀浆的加入量是病鼠脑匀浆
蛋白酶抑制剂的转化混合液中充分混合， ３ ７ ℃ 孵育 ２ ４ ｈ 。通过 Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎｂ ｌ ｏ ｔ 检测未发现 Ｐ ｒ Ｐ （ 蛋白酶抗性朊 ｒ ｅ ｓ 蛋白， Ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ａ ｓ ｅ ｒ ｅ ｓ ｉ ｓ ｔ ａ ｎ ｔ ｐ ｒ ｉ ｏ ｎｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ） 的存在。同时进行 鼠生物学分析表明， 脑内接种的小鼠长时间未出现患
循环， 每个循环为 ３ ０ｍ ｉ ｎ ， 期间进行 ４ ０ｓ 的超声波脉 冲， 完成一轮取出转化产物， 用正常的脑匀浆进行 １ ０ 稀释产物再进行下一轮的 Ｐ Ｍ Ｃ Ａ ， 这种方 １ ０ ０ ０倍稀释，
ｓ ｃ Ｍ Ｃ Ａ （ ｓ ｅ ｒ ｉ ａ ｌ Ｐ Ｍ Ｃ Ａ ） 。当最初的 Ｐ ｒ Ｐ 种 法被称为连续 Ｐ ５ ５ 子稀释至 １ ０ 倍时仍可以做为种子进行转化。新生成 ｓ ｃ ｓ ｃ 的Ｐ ｒ Ｐ 与种子 Ｐ ｒ Ｐ 相比， 自身性质基本没有区别， 具
收稿日期： ２ ０ １ ０ ０ ６ １ ８ 修回日期： ２ ０ １ ０ ０ ８ １ ０ ３ ０ ８ ７ １ ９ ５ ６ ） 资助项目 国家自然科学基金（ 电子信箱： ｚ ｓ ｌ ｉ ｕ １ ９ ５ ９ ＠１ ６ ３ ． ｃ ｏ ｍ ； ｒ ｅ ｎ ｈ ｌ ＠ｙ ａ ｈ ｏ ｏ ． ｃ ｎ 通讯作者，
速增长。在这些假设中， 可能存在一种未知蛋白或其
ｃ ｓ ｃ ｒ Ｐ 和Ｐ ｒ Ｐ 处于平衡时打破平衡， 使它们 他因素， 在Ｐ １ ］ 形成异源二聚体， 随后进一步聚集， 从而引发疾病 ［ 。 ｃ ｓ ｃ 随着研究的深入， 为了进一步明确 Ｐ ｒ Ｐ 向Ｐ ｒ Ｐ 转 ｃ 化的机理， 需要大量的适宜 Ｐ ｒ Ｐ 作为研究对象， 而且体
摘要 朊蛋白疾病是人类和动物中枢神经变性的神经退行性疾病， 严重威胁人类的健康。朊病 毒（ Ｐ ｒ ｉ ｏ ｎ ） 引发疾病的致病机理尚未十分清楚， 常采用体外合成 Ｐ ｒ ｉ ｏ ｎ的方法研究其致病机理， 但 体外研究朊蛋白的主要困难在于建立一个合适的系统模拟体内环境， 以便研究正常朊蛋白转化 为致病性朊病毒的发病机制。综述了无细胞转化分析， 细胞裂解液转化分析， 蛋白质错折叠循环 扩增， 自催化转化分析等至今普遍采用的几种 Ｐ ｒ ｉ ｏ ｎ体外合成方法， 并讨论了这些方法是否适合 用于模拟 Ｐ ｒ ｉ ｏ ｎ 在体内合成并聚集的过程， 为研究朊病毒疾病提供了丰富的研究资源， 为深入研 究朊蛋白致病性转化提供参考。 关键词 朊蛋白 朊病毒 人工表达 体外 转化
ｃ ｒ Ｐ 发生错误折叠时就会形成疾病相关型 神经元内。Ｐ ｓ ｃ 朊蛋白（ ｄ ｉ ｓ ｅ ａ ｓ ｅ ａ ｓ ｓ ｏ ｃ ｉ ａ ｔ ｅ ｄｓ ｃ ｒ ａ ｐ ｉ ｅｐ ｒ ｉ ｏ ｎｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ，Ｐ ｒ Ｐ ） ， ｓ ｃ 习惯称之为“ 朊病毒（ Ｐ ｒ ｉ ｏ ｎ ） ” 。Ｐ ｒ Ｐ 具有致病性， 可以 ｃ ｃ ｓ ｃ ｓ ｃ 但Ｐ ｒ Ｐ 转变为 Ｐ ｒ Ｐ 是需要克服能障。在没有 Ｐ ｒ Ｐ 存 ｃ ｓ ｃ ｓ ｃ 在时， Ｐ ｒ Ｐ 转变成 Ｐ ｒ Ｐ 的速度很慢； 在Ｐ ｒ Ｐ 存在时， 它 ｃ ｓ ｃ ｒ Ｐ 的结合降低了转变所需要的活化能， 使Ｐ ｒ Ｐ 迅 与Ｐ
Ｓ Ｃ ｃ ） 与Ｎ ２ ａ 细胞表达的 Ｎ Ｈ Ｍ ２Ｐ ｒ Ｐ 在含有 Ｐ Ｂ Ｓ和 ｏ ｆ Ｐ ｒ Ｐ
构象的方向移动。在成核多聚化模型中具有传染性的 物质是 Ｐ ｒ Ｐ 多聚体， 限速步骤是形成作为种子进一步
ｓ ｃ 稳定 Ｐ ｒ Ｐ 的核， 因此称为成核多聚化模型。第三， 模板 ｓ ｃ ｃ 辅助转化模型： 假设 Ｐ ｒ Ｐ 在热力学上比 Ｐ ｒ Ｐ 更稳定， ｓ ｃ
特点是所需 Ｐ ｒ Ｐ ２ ７ ３ ０只为无细胞转化分析的十五分 之 Ｈ Ｍ ２Ｐ ｒ Ｐ 与 一。实验 中 发 现， 如果将纯化后的 Ｍ Ｐ ｒ Ｐ 混合， 并不能成功转化。但是再向其中加入不含 ２ ７ ３ ０
ｃ Ｍ Ｈ Ｍ ２Ｐ ｒ Ｐ 的细胞裂解液， 就可以成功实现转化。这 ｃ
超声波以及细胞中某些未知组份的作用下， 可能会掩 盖朊蛋白向朊病毒转化的真正的机制。
中图分类号 Ｑ ８ １ ９ 在 １ ９ ８ ２年， 美国杰出生理学家 Ｐ ｒ ｕ ｓ ｉ ｎ ｅ ｒ 提出朊病 Ｐ ｒ ｉ ｏ ｎ ） 的概念， 认为 Ｐ ｒ ｉ ｏ ｎ 是一种尚未证实有核酸结 毒（ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ａ ｃ ｅ ｏ ｕ ｓｉ ｎ ｆ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｕ ｓ 构 的 蛋 白 质 侵 染 颗 粒 （ｐ ｐ ａ ｒ ｔ ｉ ｃ ｌ ｅ ｓ ） 。正 常 细 胞 型 朊 蛋 白 （ ｎ ｏ ｒ ｍ ａ ｌｃ ｅ ｌ ｌ ｕ ｌ ａ ｒｐ ｒ ｉ ｏ ｎ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ， Ｐ ｒ Ｐ） 在健康人和动物体内分布广泛， 主要集中
ｓ ｃ 析显示的明显传染性来自于新生 Ｐ ｒ Ｐ ， 其诱发疾病的 ｓ ｃ 潜伏期远长于种子 Ｐ ｒ Ｐ ， 但是两者致病后的临床症状 ｓ ｃ 和脑内空泡状特征仍然保持一致， 不随种子 Ｐ ｒ Ｐ 的稀 １ １ ］ 释浓度降低而改变 ［ 。这些实验结果说明 Ｐ Ｍ Ｃ Ａ可以
３ 细胞裂解液转化分析
外成功完成了 Ｐ ｒ Ｐ向 Ｐ ｒ Ｐ 的转化。此后， 对实验条件 ｒ ｅ ｓ 进行部分调整。以 Ｋ Ｃ ｌ 或Ｎ ａ Ｃ ｌ 来代替盐酸胍， 这样更 ５ ％。用生物 接近于体内环境， 但转化效率下降了约 ２
ｃ ｃ 素化的 Ｐ ｒ Ｐ 来代替同位素标记的 Ｐ ｒ Ｐ ， 可实现在细胞
正比。当采用程序化超声波仪和 ９ ６孔板进行 Ｐ Ｍ Ｃ Ａ 时， 可达到高通量水平， 可以用来检测 Ｐ ｒ ｉ ｏ ｎ的早期感
１ Ｐ ｒ ｉ ｏ ｎ体外合成的最初尝试
体外合成 Ｐ ｒ ｉ ｏ ｎ的想法首先由 Ｐ ｕ ｓ ｉ ｎ ｅ ｒ 等人提出。 他们采 用 直 接 混 合 的 方 法， 将从患病鼠脑中提取的 Ｐ ｒ Ｐ （ 朊病毒蛋白酶抗性片段， Ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ａ ｓ ｅ ｒ ｅ ｓ ｉ ｓ ｔ ａ ｎ ｔ ｃ ｏ ｒ ｅ ２ ７ ３ ０
引发传染性海绵状脑病， 造成人和动物的脑组织发生 神经退行性病变。目前有 ３种假说解释由正常 Ｐ ｒ Ｐ转 变为致病性 Ｐ ｒ Ｐ 。第一， 再折叠模型： 假设 Ｐ ｒ Ｐ 发生 ｒ Ｐ 的直接或间接影响 去折叠达到一定程度， 然后在 Ｐ 下发生重折叠， 形成折叠异常的致病性 Ｐ ｒ Ｐ 。第二， 成 核多聚化模型： 假设 Ｐ ｒ Ｐ和Ｐ ｒ Ｐ 处于热力学平衡， 而
ｃ 而且 Ｐ Ｍ Ｃ Ａ也受到 Ｐ ｒ ｉ ｏ ｎ 不同种系、 不同 Ｐ ｒ Ｐ 底物以及 １ ２ ］ 超声波工作强度等因素的影响 ［ 。Ｐ Ｍ Ｃ Ａ转化方式中
再将细胞裂解液与 １ ０倍分子数过量的 Ｐ ｒ Ｐ ２ ７ ３ ０共同孵
ｃ ｒ Ｐ 转化为 Ｐ ｒ Ｐ 。该方法主要 育， 可以成功实现部分 Ｐ ｒ ｅ ｓ
１ ０ ］ 。此后， 改进的 Ｐ Ｍ Ｃ Ａ要求每一轮包含 ２ ０个 染情况 ［
培养 板 上 的 高 通 量 转 化， 还 可 以 结 合 Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎｂ ｌ ｏ ｔ 或 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ等快速检测方法进行直接检测 析
［ ５ ６ ］ ［ ４ ］
。后来的研究
ｃ
ｃ ｃ ｒ Ｐ 代替哺乳动物 Ｐ ｒ Ｐ 进行分 尝试 用 人 工 表 达 的 Ｐ
中国生物工程杂志 Ｃ ｈ ｉ ｎ ａＢ ｉ ｏ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ， ２ ０ １ ０ ， ３ ０ （ １ ０ ） ： ７ ４ ７ ８
体外合成朊病毒的研究进展
刘 东 卢士英 周 玉 宫彬彬 任洪林 柳增善 （ 人兽共患病研究教育部重点实验室 吉林大学人兽共患病研究所 畜牧兽医学院 长春 １ ３ ０ ０ ６ ２ ）
ｓ ｃ ｓ ｃ Ｐ ｒ Ｐ 单体不稳定， 聚集后变得稳定。 Ｐ ｒ Ｐ 聚集体通过 ｓ ｃ ｃ 结合 Ｐ ｒ Ｐ 单体促进 Ｐ ｒ Ｐ 的转化， 使平衡向形成致病型 ｃ ｓ ｃ ｓ ｃ ｓ ｃ ｓ ｃ ｃ ｃ
内的转化研究很难达到实时监测的目的。因此， 可以 准确模拟体内环境， 并可体外大量合成的 Ｐ ｒ ｉ ｏ ｎ ， 是所有 从事相关研究的科研人员的共同期望。本文综述了近 ｒ ｉ ｏ ｎ 的反应系统， 并对这些系统的优缺 几年体外合成 Ｐ 点进行简要介绍。