冰冻切片操作流程

冰冻切片操作流程
1.包埋切片
将组织置于20%-30%蔗糖溶液1～3天沉底，利用高渗吸收组织中水分，减少组织含水量。

取出组织，预冷PBS清洗后平放于软塑瓶盖或特制小盒内（比如用铝箔纸折成有口的方盒），加入适量OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。

取出组织冰块立即置入-80℃冰箱贮存备用，或置入恒冷箱切片机冰冻切片。

2.固定
在冰冻切片机上切片，完成后用预冷的4%多聚甲醛室温固定
20-30min，冷水清洗3-5次，-20度保存。

3.冰冻切片机切片，厚度3-5微米
4.切片后固定
将切好的冰冻片用预冷的组织固定液固定30min，蒸馏水洗3-5次，洗干净固定液，自然晾干后进行下一步实验或-20℃保存
冰冻片免疫荧光实验步骤
热修复抗原:将切片浸入修复缓冲液（柠檬酸盐或EDTA修复液）,电炉或微波炉加热至沸腾后断电，间隔5-10 min后，反复1-2 次。

室温自然冷却后水洗一次
滴加封闭液（5%BSA或二抗同源血清）, 37℃孵育30 分钟。

甩去多余液体, 不洗。

滴加适当稀释的一抗，4℃过夜后37℃复温30min，也可37 ℃孵育2 h。

PBS洗5min×3 次。

滴加生物素化山羊抗小鼠IgG(或兔IgG)，37℃30 min。

PBS洗5min×3 次。

滴加试剂SABC-FITC，37℃孵育30 min。

PBS洗5 min×4 次。

DAPI复染2-3min，充分水洗，封片观察。