蔗糖酶米氏常数的测定
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1. 仪器：分光光度计、恒温水浴、试管、吸管、秒表、 坐标纸 2．试剂 标准葡萄糖溶液（1 mg/mL） 3%蔗糖溶液（87.7 mM） 0.2 mol/L NaAc缓冲溶液（pH4.6） 0.5 mol/L NaOH溶液 3,5-二硝基水杨酸试剂
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【操作步骤】 1．葡萄糖标准曲线的制定
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2．底物浓度和初速度υ测定
① 取试管8支编号，按下表将蔗糖溶液，醋酸缓冲液分别加入试管，
于37℃水浴中保温10min。一定量酶液同一水浴中保温约10min。
② 于各管中依次按同样间隔(0.5min)加入已保温过的酶液1.0mL，
计时，立即摇匀，在37℃中准确温浴5min。
③ 按同样次序和时间间隔，加入1mL 0.5mol/L NaOH，摇匀，终止
为横坐标，以1/v为纵坐标作图，绘出一条直线，外推至
横轴相交，横轴截距即为-1精/选Kppmt 。
1
v
VMAX
1/2VMAX
Vmax•[S] V=
Km + [S]
Km
底物浓度与反应速度关系曲线
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[S]
2
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3
还原糖与3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂反应：
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4
【仪器与试剂】
反应。
④ 吸取反应物1.0mL，加入盛有3.0mL 3，5-二硝基水杨酸试剂和
1.0mL水的试管中混匀，放入沸水浴中加热5min，冷却后稀释至
25mL，摇匀，在540nm比色测定A值。
⑤ 以A值对应的葡萄糖量为相对反应速度，以1/[S]为横坐标，1/v
为纵坐标作图，由图求出Km精值选p。pt
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反应物
终止反应
活力测定
数据处理
管 3% 醋酸 酶液 1mol／L 吸取 水杨 水 A540 υ 底物 1/[s] 1/υ
号 蔗糖 缓
NaOH 反 酸 (mL)
浓度
液 冲液 (mL) (mL) 应物 试剂
(mL) (mL)
(mL) (mL)
10
5.0 1.0 1.0
2 0.5 4.5 1.0 1.0
3 1.0 4.0 1.0 1.0
4 1.5 3.5 1.0 1.0
5 2.0 3.0 1.0 1.0
6 2.5 2.5 1.0 1.0
7 3.75 1.25 1.0 1.0
8 5.0 0
1.0 1.0
1.0 3.0 1.0 1.0 3.0 1.0 1.0 3.0 1.0 1.0 3.0 1.0 1.0 3.0 1.0 1.0 3.0 1.0 1.0 3.0 1.0 1.0 3.0 1.0
管号
0
1
2
3
4
5
ห้องสมุดไป่ตู้
葡萄糖标准液(mL)
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
蒸馏水(mL)
2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0
3,5-二硝基水杨酸试剂 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 (mL)
将各管溶液混合均匀，在沸水浴中加热5min，取出后立即用 冷水冷却至室温，以蒸馏水稀释至25mL，摇匀。测540nm处 A值。以葡萄糖含量（mg）为横坐标，A值为纵坐标作出标准 曲线。
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蔗糖酶米氏常数的测定
【目的】：了解底物浓度与酶反应速度间的关系，学习求 蔗糖酶米氏常数的方法
【原理】：米氏方程式 v = Vmax[S] Km +[S]
米氏常数的求法很多，最常用的是Lineweaver—Burk的 作图法(双倒数作图法)。 米氏方程式可改写为下列倒数形式：
选择不同的[s]，测定相应的v，求出两者的倒数，以1/[s]
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【操作步骤】 1．葡萄糖标准曲线的制定
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2．底物浓度和初速度υ测定
① 取试管8支编号，按下表将蔗糖溶液，醋酸缓冲液分别加入试管，
于37℃水浴中保温10min。一定量酶液同一水浴中保温约10min。
② 于各管中依次按同样间隔(0.5min)加入已保温过的酶液1.0mL，
计时，立即摇匀，在37℃中准确温浴5min。
③ 按同样次序和时间间隔，加入1mL 0.5mol/L NaOH，摇匀，终止
为横坐标，以1/v为纵坐标作图，绘出一条直线，外推至
横轴相交，横轴截距即为-1精/选Kppmt 。
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v
VMAX
1/2VMAX
Vmax•[S] V=
Km + [S]
Km
底物浓度与反应速度关系曲线
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[S]
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还原糖与3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂反应：
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【仪器与试剂】
反应。
④ 吸取反应物1.0mL，加入盛有3.0mL 3，5-二硝基水杨酸试剂和
1.0mL水的试管中混匀，放入沸水浴中加热5min，冷却后稀释至
25mL，摇匀，在540nm比色测定A值。
⑤ 以A值对应的葡萄糖量为相对反应速度，以1/[S]为横坐标，1/v
为纵坐标作图，由图求出Km精值选p。pt
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反应物
终止反应
活力测定
数据处理
管 3% 醋酸 酶液 1mol／L 吸取 水杨 水 A540 υ 底物 1/[s] 1/υ
号 蔗糖 缓
NaOH 反 酸 (mL)
浓度
液 冲液 (mL) (mL) 应物 试剂
(mL) (mL)
(mL) (mL)
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5.0 1.0 1.0
2 0.5 4.5 1.0 1.0
3 1.0 4.0 1.0 1.0
4 1.5 3.5 1.0 1.0
5 2.0 3.0 1.0 1.0
6 2.5 2.5 1.0 1.0
7 3.75 1.25 1.0 1.0
8 5.0 0
1.0 1.0
1.0 3.0 1.0 1.0 3.0 1.0 1.0 3.0 1.0 1.0 3.0 1.0 1.0 3.0 1.0 1.0 3.0 1.0 1.0 3.0 1.0 1.0 3.0 1.0
管号
0
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ห้องสมุดไป่ตู้
葡萄糖标准液(mL)
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
蒸馏水(mL)
2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0
3,5-二硝基水杨酸试剂 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 (mL)
将各管溶液混合均匀，在沸水浴中加热5min，取出后立即用 冷水冷却至室温，以蒸馏水稀释至25mL，摇匀。测540nm处 A值。以葡萄糖含量（mg）为横坐标，A值为纵坐标作出标准 曲线。
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蔗糖酶米氏常数的测定
【目的】：了解底物浓度与酶反应速度间的关系，学习求 蔗糖酶米氏常数的方法
【原理】：米氏方程式 v = Vmax[S] Km +[S]
米氏常数的求法很多，最常用的是Lineweaver—Burk的 作图法(双倒数作图法)。 米氏方程式可改写为下列倒数形式：
选择不同的[s]，测定相应的v，求出两者的倒数，以1/[s]