质粒DNA的提取和纯化

质粒DNA的提取和纯化
一、实验目的
掌握碱法小量提取质粒DNA。

二、实验内容
质粒DNA的小量提取。

三、实验原理
所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤：培养细菌扩增质粒；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。

将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，将质粒DNA释放到上清液中。

碱性溶剂使碱基配对完全被破坏，闭环质粒DNA双链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。

当pH值恢复到中性时，重新形成完全天然地超螺旋结构。

在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，与PDS一起沉淀。

离心除去变性剂，从上清液中回收复性的质粒DNA。

四、实验方法与步骤
㈠细菌培养和收集
将带有pUC19质粒的大肠杆菌接种在LB固体培养基（含100μg/ml Amp）中，37℃培养12～24小时。

在超净工作台中用无菌的牙签挑取平板培养基上的单菌落接种到25ml LB液体培养基（含100μg/ml Amp）中，37℃振荡培养（220rpm）约18小时至对数生长后期（OD600=0.6）。

㈡碱法小量提取质粒DNA
1、将菌液倒入1.5ml的微量离心管中，于4℃12000rpm离心30秒，弃去上清液，将剩余的培养物贮存于4℃。

重复3次，以得到较多的细菌沉淀（视具体情况而定）。

2、将微量离心管开口倒置在卫生纸上，使离心管底部的液体流尽。

3、加入100μl用冰预冷的溶液I，在涡旋振荡器上剧烈振荡，将沉淀彻底悬浮，然后室温放置5分钟。

4、加入200μl现配的溶液II，盖紧管口，轻轻快速颠倒离心管（不要振荡，以避免DNA断裂），使混合物混匀，冰浴2～5分钟。

5、加入150μl预冷的溶液III，盖紧管口，温和颠倒混匀，使粘稠地细菌裂解物均匀地分布于溶液III中，冰浴2～5分钟。

6、4℃,12000rpm离心10分钟。

将上清液转入另一只1.5ml离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，室温放置10分钟。

7、4℃，12000rpm离心10分钟。

弃去上清液，在沉淀中加入TE缓冲液500μl，充分溶解。

8、加入等体积氯仿：异戊醇（24︰1），上下颠倒混匀约30次。

4℃，12000rpm离心10分钟。

9、取上部水相，移入新的离心管，加入2倍体积预冷的无水乙醇（也可同时加入1/10倍体积的醋酸钠），震荡混匀，室温放置10分钟沉淀双链DNA，然后4℃，12000rpm离心10min。

10、弃去上清液，将离心管倒置于卫生纸上，使离心管底部的液体流尽后，加入预冷的1ml 70％乙醇。

11、弃去上清液，将离心管倒置于卫生纸上，使液体流尽，置DNA浓缩干燥仪中干燥5～10分钟。

12、将沉淀溶于30μl TE缓冲液，置－20℃保存备用。

五、场地、设备与器材
微量移液器，微量离心管(eppendorf管)，离心管架、台式高速离心机、恒温振荡摇床、涡旋振荡器、电泳仪、琼脂糖平板电泳槽、恒温水浴锅、紫外分光光度计、DNA浓缩干燥仪。