植物原位杂交

植物原位杂交
植物RNA 原位杂交⽅法
⼀、制⽚
1. 材料的固定和包埋
固定液：FAA: 10%甲醛，5%冰醋酸，50%⼄醇（均为RNase-free, DEPC ⽔配制）Day 1:
取植物材料，茎尖或花原基（如花原基，不要剥除最外层苞⽚），⽴即放⼊FAA，抽真空15min，缓慢放⽓，换⼀次固定液，4℃过夜。

Day 2:
脱⽔：
50%⼄醇30min
50%⼄醇60min
60%⼄醇60min
70%⼄醇60min 组织块可在70%⼄醇中4℃保存达⼏个⽉
Day 3:
85%⼄醇60min
95%⼄醇60min
100%⼄醇30min
100%⼄醇30min
100%⼄醇60min
25%⼆甲苯+75%⼄醇60min 以下有⼆甲苯，在通风橱中操作
50%⼆甲苯+50%⼄醇60min
75%⼆甲苯+25%⼄醇60min
100%⼆甲苯60min
100%⼆甲苯60min
100%⼆甲苯60min 组织透明，也可两次100%⼆甲苯，第⼆次⾄组织透明为⽌
50%⼆甲苯+50%⽯蜡58℃过夜
Day 4:
换两次100%⽯蜡（58℃），倾倒时避免产⽣起泡
Day 5:
换两次100%⽯蜡（58℃），倾倒时避免产⽣起泡
Day 6:
换两次100%⽯蜡（58℃），倾倒时避免产⽣起泡
⽤⼲净较硬的纸（如打印纸）折好纸盒，薄的可双层折。

包埋。

2. 杂交探针的制备
1）将要转录的DNA(通常50-300bp，⽆polyA 尾)克隆在PGEM T-easy vector 上，摇菌，提质粒，送样测序，确定⽬的⽚段的连⼊⽅向（以T7 或者SP6 引物测序出的连⼊⽅向，即是⽤T7 或是SP6 转录酶转录出的sense 探针的⽅向。

例如，某⽚段T7引物的测序结果是反向连⼊，则⽤T7 转录出的探针是antisense,才是正确探针）
2）⽤T7，SP6 引物从质粒上将⽬的⽚段扩增出来（⼤体积扩增，通常200-400ul）。

若产物
⼲净则可直接回收，不⼲净切胶回收。

回收⽤RNase-free 的管⼦，NFW ⽔溶解（30-40ul, 浓度>200ng/ul）
3）⽤回收产物转录
T7:
DNA 300-500ng
10×T7 buffer 1ul
10×labeling mix 1ul
Inhibitor 0.5ul37℃1hr
T7 polymerase 1ul
DTT 1ul
NFW 补⾜10ul
SP6:
DNA 300-500ng
10×SP6 buffer 1ul
10×labeling mix 1ul
Inhibitor 0.5ul40℃1hr
Sp6 polymerase 1ul
1%BSA 1ul
NFW 补⾜10ul
DNase 消化:
转录产物10ul
10×buffer 6ul37℃15min DNase I 3ul
NFW 补⾜60ul
沉淀：
消化产物60ul
4M LiCl 7.5ul
0.2M EDTA(可灭活酶活) 7.5ul
100%⼄醇225ul
/总体积300ul -80℃过夜
4℃，12000rpm, 20min 去上清
75%⼄醇洗，4℃，7500rpm 5min
同上，再洗⼀次
冰上开盖，晾⼲
30ul NFW 溶解，沉淀前、后分别取1-2ul 电泳
4）探针定量
1 将合成的探针和对照各取1ul 点到Nylon membrane 上
2 UV-cross linker(2400)
3 将膜放到2ml 冻存管中
4 2ml Washing buffer 2min
5 2ml Blocking solution 30min
6 2ml Antibody solution 30min
7 2ml Washing buffer 15min
8 2ml Washing buffer 15min
9 2ml Detection buffer 2-5min
10 2ml Detection buffer+20ulNBT/BCIP（2:1）锡箔纸包裹冻存管，5min 看⼀次
探针定量所需试剂：
3. 切⽚
将已⽤⽯蜡包埋好的植物材料修成梯形，切成8um 厚的蜡带材料（尽量少带⽯蜡，
但不能过少，因为材料周围的⽯蜡太少，则容易切断，不易形成蜡条，⽽且梯形要规整，否则蜡带会绕圈，不⽅便展⽚）。

按顺序摆放，正⾯朝上。

在解剖镜下⽤暗视野观察蜡带，以决定取舍。

在聚赖氨酸化的载玻⽚（Fisher）上⾯铺满DEPC ⽔，然后挑选合适的蜡带⼩⼼地
放在⽔⾯上（可在⼀张⽚上摆上从⼤到⼩不同时期）（注意正反⾯）,蜡带完全展开后（42℃烫板上数分钟⾄⼏⼗分钟不等，注意观察以免展过，以组织不开裂为度），⽤
⼀张镜头纸轻轻压在蜡带上，然后⽤吸⽔纸（枪头）吸掉载玻⽚上多余的⽔，使材料与
载玻⽚之间⽆⽔存在，置于42℃烫板上烘烤⼲燥36-48hr 后备⽤，制好的⽚⼦最好在⼀星期内进⾏杂交）
⼆、⽚⼦预处理
1. Deparaffine and rehydration
100% xylene ⼆甲苯20min——100% xylene 20min——75% xylene+25% ethanol 2min ——25% xylene+75% ethanol——100% ethanol——95% ethanol——80% ethanol——60%
ethanol——30% ethanol——DEPC H2O( each step 2 min after the 1st and 2nd steps)
2. 0.25M HCl 20min (862ul HCl→40ml H2O)
3. DEPC-H2O 5min
4. 2×SSC 20min
5. DEPC-H2O 5min
6. Proteinase K: Proteinase K buffer (37℃pre-warmed,40ml) + Proteinase K (8ul,
20mg/ml) 37℃,30min
K buffer: 32ml DEPC-H2O + 4ml 1M Tris-HCl pH7.5 + 4ml 0.5M EDTA pH7.5
7. RT, 1×PBS, 2min
8. RT, 0.2% glycine in 1×PBS, 2min (0.08g glycine 现称in 40ml 1×PBS)
9. RT, 1×PBS, 2×2min
10. RT, 4% formaldehyde, 10min( (4.3ml 甲醛溶液（浓度37%-40%）+35.7ml 1×PBS)
11. RT, 1×PBS, 2×5min
12. To reduce background: (现⽤现加）
0.1M triethanolamine pH8.0(三⼄醇胺,不调pH)with 0.5% acetic anhydride（⼄酸
酐）,with constant stirring.
Add 536ul triethanolamine +160ul HCl pH8.0(不调pH),and 200ul acetic anhydide
in 40ml PBS and immediately add slides. Incubate at RT for 5min.
13. RT, 1×PBS, 2×5min
三、杂交
1.杂交体系
每张⽚⼦⼤约⽤100-150ul 杂交液，杂交液由A 和B 组成，⽐例为150ul 杂交液由
115.8ul 杂交液A 加34.2ul 杂交液B 组成
杂交液A 15.44ml: 10ml 去离⼦甲酰胺
2ml 50% dextran sulfate (1g 溶于2ml formamide)
2ml 10×blocking solution
1.2ml 5M NaCl
0.2ml 1M Tris-HCl pH7.5
0.04ml 0.5M EDTA pH7.5
杂交液B 34.2ul: 2.2ul tRNA
32ul probe+DEPC-H2O
杂交液B 80℃5min 变性后⽴即放置冰上5min
2.杂交
⽤parafilm 膜或者盖玻⽚轻轻覆盖预处理后的⽚⼦，42℃（42℃-50℃）在湿室中杂交
过夜（湿室中垫有⽤0.3M NaCl-2×SSC-50%甲酰胺饱和的吸⽔纸，放在⼀个⼤平⽫中，每⽫需要50ml)
四、冲洗
1. 准备冲洗缓冲液2×SSC，50%甲酰胺（国产），准备2 次⽤量
20×SSC 50ml 5ml 4ml 8ml
甲酰胺（国产）250ml 25ml 20ml 40ml
DEPC-H2O 200ml 20ml 16ml 32ml
总体积500ml(⼤）50ml（⼩）40ml 80ml
20×SSC (pH7.0) 1L: NaCl 173.5g
Na3citrate 柠檬酸钠88.2g
2. 染缸中加⼊冲洗缓冲液，放⼊载玻⽚，50℃⽔浴中温育30min（此时盖玻⽚会落下）
3. 在冲洗过程中准备NTE 溶液，准备5 次⽤量。

5×NTE (pH7.5) 1L: NaCl 146.1g
Tris 6.05g
EDTA 1.86g
5 次
6 次
5×NTE 500ml 60ml
DEPC-H2O 2000ml 240ml
总体积2500ml(⼤）300ml(⼩染缸）
4. ⽤NTE 溶液，在37℃⽔浴中冲洗两次，每次5min
5. 准备RNA 酶A 溶液（20ug/ml),将载玻⽚放⼊溶液中37℃⽔浴温育30min
RNA 酶A 储备液10mg/ml 1ml 0.1ml
NTE 溶液500ml(⼤染缸）50ml(⼩染缸）
注：（1）RNA 酶A 溶液应提前放⼊37℃⽔浴中预热5min
(2) 加⼊RNA 酶以后各步使⽤蒸馏⽔即可
（3）加⼊RNA 酶A 之前和之后使⽤的玻璃缸⼀定要分开放置，切勿混⽤！
（4）加⼊RNA 酶A 之前使⽤的玻璃缸，每次⽤完后冲洗⼲净，加⼊部分100%⼄醇
溶液，下次使⽤在通风橱中吹⼲即可。

6. 准备溶液：
1）1×SSC：
20×SSC 25ml 2.5ml 2ml
⽔475ml 47.5ml 38ml
总体积500ml(⼤染缸）50ml（⼩染缸）40ml
2) 10×PBS( 1×PBS: 130mM NaCl, 7mM Na2HPO4.7H2O, 3mM NaH2PO4.H2O)
NaCl 15.194g 22.791g 37.985g Na2HPO4.7H2O(Na2HPO4.12H2O) 3.752g(5.012g) 5.628g(7.518g) (12.53g) NaH2PO4.H2O(NaH2PO4.2H2O) 0.828g(0.936g） 1.242g(1.404g) (2.34g) 体积200ml 300ml 500ml 3) 1×PBS: 10×PBS(pH6.5-7.0)50ml5ml
⽔450ml45ml
总体积500ml(⼤染缸）50ml(⼩染缸）
7. NTE 溶液，室温冲洗两次，每次5min,37℃
8. 冲洗缓冲液，50℃⽔浴，温育1hr
9. 1×SSC，RT，2min
10. PBS,RT,5min
五、抗体染⾊
1.准备溶液：
10×DIG 1 (pH8.0) 1L: Tris 121.1g
NaCl 87.7g
1)DIG1:(配10 个，DIG2，DIG3 均在DIG1 基础上配制）
10×DIG1 400ml 50ml 40ml
⽔3600ml 450ml360ml
总体积4000ml(⼤染缸）500ml(⼩染缸）400ml
2)DIG2:
10×Blocking reagent 50ml 5ml 4ml
DIG1 450ml 45ml 36ml
总体积500ml(⼤染缸）50ml(⼩染缸）40ml
注：新鲜配制，在60-70℃⽔浴中溶解1hr，溶液仍显浑浊。

Blocking reagent 本⾝有很
多类似核酸的⽚段，可⽤于封闭核酸。

这⼀步的⽬的是防⽌⾮特异性的吸附
3)DIG3:(准备5-6 次⽤量）
⽜⾎清⽩蛋⽩（BSA) 25g 3g 0.5g
DIG1 2500ml 300ml50ml
Triton X-1007.5ml 0.9ml0.15ml
总体积2500ml(⼤）300ml（⼩，6 次）50ml(1 次）注：当天新鲜配制，这⼀步的⽬的是封闭蛋⽩
4）DIG4：(不⽤染缸，直接点在⽚上，节约）
每张⽚150ul, 10 张1.5ml
加⼊抗体anti-digoxingenin-AP(1:3000) 0.5ul
注：使⽤前2-3min 前再配制
5）DIG5：(准备2-3 次⽤量，两⼩盒染⾊）
0.5M Tris pH9.5 20ml 30ml
5M NaCl 2ml 3ml
1M MgCl2(MgCl2.6H2O）1.016g 1.524g
SDW 78ml 117ml
体积100ml 150ml
6）DIG6:25ml/枪头盒
DIG5 75ml(3 盒或⼤盒）150ml(6 盒）
NBT(50mg/ml) 225ul 450ul 总浓度0.15mg/ml BCIP(50mg/ml) 112.5ul 225ul0.075mg/ml 注：使⽤前再配制，配制时应避光
2.染⾊
DIG1 5min
DIG2 60min（封闭，可超过1hr) RT
DIG3 30min
DIG4 90min-2hr RT
3.冲洗
DIG3 4×20min (2-4 次，摇床上摇）
4.平衡
DIG1 5min
DIG5 5min
5.显⾊
在每⼀个枪头盒中加⼊25ml DIG6，将⽚⼦放⼊其中，显⾊液没过⽚⼦即可。

6.将盒⼦盖好，密封（避免蒸发），⽤锡箔纸包好（避光），置⿊暗处显⾊36hr 或更长，每隔12hr 检查显⾊情况，以免背景过深（可以放在28℃烘箱中）
（可以在此时拍照，滴加⽆⽔⼄醇，盖上盖玻⽚，注意要快⼀些照，以防信号消失）
7.终⽌酶反应，洗去背景，将载玻⽚放回染缸中进⾏冲洗（此时应根据切⽚的染⾊情况决定冲洗的时间，如果背景染⾊不深的话，越短越好）
停显液：PBS (pH7.4)+20mM EDTA
PBS (pH7.4): 131mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4.12H2O, 2mM KH2PO4
10×PBS(pH7.4) 1L:NaCl 80g
KCl 2g
Na2HPO435.8g
KH2PO4 2.7g
HCl 调pH ⾄7.4，定容⾄1L
蒸馏⽔5s
70%⼄醇5s
95%⼄醇5s
100%⼄醇5s
95%⼄醇5s
70%⼄醇5s
蒸馏⽔5s
注：（1）冲洗的时间需镜检后再决定，若背景较弱则处理时间相应减少。

（2）终⽌前信号呈粉红⾊，经⼄醇脱⽔复⽔后变为紫⾊。

六、荧光染⾊
1.⽤⽔配置0.1%的荧光染料（Fluorescent brightener, Sigma)
注：（1）⽤⼀次配⼀次
（2）溶解⼀段时间后，低俗离⼼，取上清液去染⾊（也可⽤细菌过滤免菌期过滤以除去颗粒）（3）每8 ⽚载玻⽚染⾊后，不必换新的荧光染料
2.载玻⽚在荧光染料中染⾊5 分钟
3.很快⽤⽔冲洗⼀下，放在超净台上吹⼲
七、封⽚
⼋、封⽚
滴加50ul（视材料⽽定）国产中性树胶，轻轻盖上盖玻⽚，避免产⽣⽓泡。

注：封⽚后⼀定要在通风橱中过夜⼲燥，才能在荧光显微镜下观察
△多聚赖氨酸，⼯作浓度1mg/ml(配的母液浓度5mg/ml)
每张⽚⼦涂10ul__。