利用Tet-Off表达系统构建鞘磷脂合酶可调控高表达的Huh7肝癌细胞

利用Tet-Off表达系统构建鞘磷脂合酶可调控高表达的
Huh7肝癌细胞
颜念龙;吴满平
【摘要】目的利用Tet-Off表达系统构建鞘磷脂合酶(sphingomyelin synthase,SMS)可被Dox调控高表达的Huh7细胞,为进一步探讨SMS活性升高致动脉粥样硬化的机制打下基础(建立细胞模型).方法首先将Tet-Off调控质粒转染Huh7细胞构建Huh7-tTA细胞,然后再将含外源性人SMS基因(hSMS)的PTREE2hyg质粒转染Huh7-tTA细胞,经分离纯化成功构建可调控表达hSMS的Huh7单克隆细胞(命名为SMS细胞,SMS1和SMS2).为了便于检测外源性hSMS,利用FLAG标记hSMS(SMS-FLAG).结果 SMS细胞表达SMS-FLAG受不同剂量Dox调控,SMS mRNA测定结果显示:0 ng/mL Dox剂量组较0.01 ng/mL和100 ng/mL Dox组均有显著升高(P<0.05和P<0.001);0.01 ng/mL Dox组较100 ng/mL Dox组也有显著升高(P<0.05).SMS蛋白测定结果相似于SMSmRNA结果.SMS酶活性测定结果显示0 ng/mL Dox组显著高于100 ng/mLDx组
(P<0.001),而对照组(Huh7-tTA)、100 ng/mL Dox组和野生型Huh7细胞组之间差异均无统计学意义(P>0.05).结论利用Tet-Off体系成功构建SMS高表达可调控Huh7细胞,SMS细胞SMS高表达受Dox剂量调控.
【期刊名称】《复旦学报（医学版）》
【年(卷),期】2010(037)006
【总页数】5页(P719-723)
【关键词】Tet-Off调控系统;鞘磷脂合酶;Huh7细胞
【作者】颜念龙;吴满平
【作者单位】复旦大学药学院生物化学教研室,上海,201203;复旦大学药学院生物化学教研室,上海,201203
【正文语种】中文
【中图分类】Q813
Tet-Off是一种高效、低毒及具有高诱导能力的表达外源基因的调控系统,其由两种质粒构成:调控质粒和反应质粒,调控质粒可表达tTA蛋白,tTA可与反应质粒中的转录调控序列TRE发生识别并启动反应质粒中目的基因的表达。

同时tTA可与强力霉素(doxycycline,Dox)或四环素(tetracycline,T c)发生结合,tTA与 TRE的结合能力和Dox或 T c的剂量正相关,而结合了Dox或 T c的tTA不能与 TRE结合,进而阻碍了调控质粒中目的基因的表达[1],因此利用Tet-Off表达调控系统可精确调控SMS基因在Huh7中的表达量。

动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是危害人类健康的最常见的心血管疾病。

同时流行病学调查显示,人血浆SM水平和SM/PC比例升高是AS独立危险因子,血浆SM水平在评价AS发展过程中具有指标意义[2]。

SM在生物体内的合成是由一系列的酶所催化,鞘磷脂合酶(sphingomyelin synthase,SMS)是这一系列酶中的最后一个关键酶,SMS利用神经酰胺(ceramide)和卵磷脂(phosphatidylcholine,PC)作为底物催化生成SM和二酰甘油(diacylglycerol,DAG)。

SMS具有两种同工酶SMS1和SMS2,SMS1位于高尔基体中,而SMS2则定位于细胞膜中[3-4]。

本研究利用 T et-Off表达调控系统构建SMS可调控高表达 Huh7细胞,为进一步探讨SMS活性升高致动脉粥样硬化的机制打下基础(建立细胞模型)。

材料和方法
Tet-Off-SMS-FLAG表达调控系统的构建活化的 Huh7细胞在6孔板中培养,待细胞融合度达到90%时 ,利用lipofectamine 2000(美国 Invitrogen公司)转染调控
质粒(p Tet-Off Vector),并用G418(250μg/mL,美国 Amresco公司)筛选单克隆
细胞,将筛选到的单克隆细胞命名为 Huh7-t TA;再次利用lipofectamine 2000将
连接了 SMS-FLAG(hSMS-FLAG)基因的反应质粒(Tet-Off-
SMSFLAG,PTREE2hyg连接 SMS-FLAG基因,由美国纽约大学下州医学中心蒋宪
诚教授提供)转染Huh7-t TA 细胞 ,用Hygromycin B(250μg/mL,美国Amresco
公司)筛选单克隆细胞,将所筛选到的SMS表达水平最高的单克隆细胞命名为
SMS1和SMS2。

利用Dox调控SMS1和SMS2细胞中SMS-FLAG的表达 SMS1和SMS2细胞分别培养在含有不同剂量Dox(0、0.01、100 ng/mL,上海碧云天生物技术有限公司)的DMEM培养基中,培养48 h后,收获细胞用于RT-PCR、Western blot和酶活(TLC法)分析。

RT-PCR分析 SMS1和 SMS2细胞 SMS-FLAG mRNA表达水平 Trizol(日本TaKaRa公司)提取SMS1和SMS2中的RNA,随后利用2μg RNA进行RT-PCR
反应(加拿大 Fermentas公司),并用β-actin作为内参。

在 RT-PCR实验中用于检
测SMS1-FLAG、SMS2-FLAG和β-actin基因的引物如下(美国Invitrogen 公司)。

SMS1-FLAG:上游5′-GGCTTCTCAGCGTAGTTGGA-3′,下游5′-TCATCGTCATCCTTGTAATCG-3′,扩增长度为367 bp。

SMS2-FLAG:上游5′-TATTCGCCTCGTCACTTCTGG-3′,下游5′-TCATCGTCATCCTTGTAATCG-3′,扩
增长度为431 bp。

β-actin:上游5′-GGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-,下
游5′-GCATTTGCGGTGGACGATGGAGG-3′,PCR产物片断长度为650 bp。

Western blot分析SMS1和SMS2细胞SMS-FLAG蛋白表达水平利用裂解缓冲
液(上海碧云天生物技术有限公司)裂解培养好的SMS1和SMS2细胞,并用BCA法测定蛋白浓度(上海荔达生物科技有限公司)。

每个样品取20μg进行Western blot实验。

在实验中 GAPDH作为内参蛋白。

一抗:GAPDH和FLAG抗体;二抗为Pierce公司产品。

SMS1和SMS2细胞酶活测定细胞匀浆5 000 r/min离心10 min。

收集上清,测定各组SMS粗酶提取物的蛋白含量。

按照以下反应体系测定细胞酶活:70μL反应缓冲液,PC(20 mg/mL,美国 Invitrogen公司)3μL,NBD-Ceramide(0.5 mg/mL,美国 Invitrogen-MP公司)4μL,加入相同蛋白量的SMS粗酶提取物,加蒸馏水至700μL反应体系。

混匀后于37℃温浴2 h,每管加入等体积(700μL)氯仿∶甲醇(2∶1)混合液,涡旋振荡1 min。

8 000 r/min离心10 min后吸弃上清,各组吸取等体积下层有机相转移到新Eppendorf管中,氮气吹干有机溶剂,各管再加入50 μL 氯仿溶解脂类物质。

氯仿:甲醇:浓氨水(14∶6∶1)作为层析液,层析15 min,在生物电泳图像分析系统的紫外线下观察荧光条带,拍照后对各条带密度定量分析(Smartview软件分析)[5]。

统计方法实验结果以±s表示,两组间比较采用Studentt检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

结果
SMS-FLAGmRNA水平的检测将筛选到的单克隆SMS1和SMS2,利用不同剂量Dox(0、0.01、100 ng/mL)处理单克隆细胞,并检测SMS-FLAG是否受Dox的调控。

图1结果显示,在mRNA水平SMS1-FLAG和SMS2-FLAG的表达受Dox调节,并计算SMS1和SMS2细胞的增加倍数[增加倍数=(样本组表达量-本底)/本底,本底为100 ng/mL Dox],0 ng/mL Dox和0.01 ng/mL Dox分别与100 ng/mL Dox相比,mRNA表达的增加倍数分别为0.96(P＜0.001)和0.39(P＜0.05),2.92(P ＜0.001)和1.40(P＜0.001)。

0 ng/mL Dox与0.01 ng/mL Dox相比,SMS1和
SMS2细胞 mRNA表达分别增加0.41倍(P＜0.05)和 0.63倍(P＜0.001),提示SMS mRNA表达受Dox剂量调控。

图1 RT-PCR检测SMS-FLAG mRNA 的表达Fig 1 Analysis of the SMS-FLAG mRNA expression by RT-PCRA : The expression of SMS1-FL A G mRNA in SMS1 cells ; B : The expression of SMS2-FL A G mRNA in SMS2 cells. 1 :100 ng/ mL Dox ; 2 :0 . 01 ng/ mL Dox ; 3 :0 ng/ mL Dox ; Marker :DL2000 . vs. 100 ng/ mL Dox ,(1)P＜0.05,(2)P＜0.001;vs.0.01ng/mLDox,(3)P＜0.05,(4)P＜0.001.
SMS-FLAG蛋白水平的检测由于迄今为止还未研制出SMS的抗体,本研究利用SMS末端所带的FLA G标签蛋白作为检测目标。

结果显示,SMS1和SMS2细胞(图2)经不同剂量Dox处理后标签蛋白FLAG的表达也受Dox剂量调控,经密度定量分析可计算SMS1和SMS2细胞蛋白表达增加率,SMS1-FLA G分别增加 1.82倍和 1.00倍(0 ng/mL、0.01 ng/mL与100 ng/mL Dox比较,计算方法同上);而SMS2-FLAG分别增加2.09和0.95倍;与0.01 ng/mL Dox相比0 ng/mL Dox组SMS1和SMS2细胞蛋白分别增加0.41倍和0.58倍。

由此可知SMS-FLAG在蛋白水平的表达也受Dox剂量依赖性调控。

SMS1和SMS2细胞酶活的鉴定图1和图2结果显示,SMS1-FLAG和SMS2-FLAG在mRNA水平和蛋白水平的表达都受Dox调控,且呈剂量依赖性;图3结果显示,Dox调控前后SMS1和SMS2细胞酶活的诱导差异有显著统计学意义(P＜0.001)。

100 ng/mL Dox剂量时,SMS1和 SMS2细胞的酶活与对照(Huh7-t TA)间的酶活比较差异无统计学意义(P＞0.05),故可知100 ng/mL Dox时几乎可完全抑制SMS-FLAG的表达,SMS1和SMS2单克隆细胞中本底的表达水平较低。

而由图3C结果显示野生型 Huh7和 Huh7-t TA细胞中SMS酶活差异无统计学意义(P ＞0.05),可见导入的调控质粒(t TA)对SMS细胞的酶活无影响。

讨论
动脉粥样硬化与脂质代谢密切相关。

肝脏在体内脂质、脂蛋白代谢和转运过程中起关键作用:肝脏是体内胆固醇、ApoA-I、ApoB100、三酰甘油、磷脂生物合成的重要器官;合成分泌新生 HDL和VLDL;同时又能选择性吸收 HDL2-胆固醇酯,参与体内胆固醇逆转运;肝细胞表面的各种脂蛋白受体如 SR-BI、ApoB和ApoE的受体、ABCA1和ABCG1等参与体内脂蛋白和脂质代谢;肝脏中胆固醇代谢成胆汁酸排出体外,因此肝细胞通过调节脂质代谢影响动脉粥样硬化进程。

本研究采用Huh7肝癌细胞株作为实验材料,建立肝细胞高表达SMS模型,为研究肝脏SMS过表达对脂质代谢及动脉粥样硬化影响打下基础[6-7]。

图2 Western blot 检测SMS-FLAG蛋白水平的表达Fig2 A : The expression of SMS1-FL A G in SMS1 cells ; B : The expression of SMS2-FL A G in SMS2 cells.x—±s,n=2.1:100ng/mL Dox;2:0.01ng/mLDox;3:0ng/mL Dox.
图3 层析法检测SMS 酶活Fig3 Determination of SMS activity by TLCA : The SMS activity in SMS1 cells ; B : The SMS activity in SMS2 cells ; C : The SMS activity in Huh7 and Huh7-t TA cells. vs.100 ng/ mL Dox and Cont rol
( Huh7-t TA) , respectively ,(1)P＜0.001.
SMS功能研究是目前动脉粥样硬化领域中热点之一。

由于至今SMS蛋白尚未被纯化,市场也无其抗体供应,因此我们实验设计中引入 FLAG标记SMS基因,以便检测SMS-FLAG mRNA、SMS-FLAG蛋白水平。

SMS酶活性检测我们引用文献[5]及本实验室[8]以前报道的方法:即利用荧光标记的SMS底物NBD-CER,在 SMS作用下生成荧光标记产物NBD-SM。

荧光标记基团NBD经紫外照射后可激发出白色荧光,荧光吸收值和NBD的量成正比,经TLC分离后,NEB-CER和NEB-SM呈现不同迁移率的两条分离条带。

荧光扫描NBD-SM/NBD-CER荧光强度比值即反映SMS活性。

以对照组(Huh7-tTA)SMS活性设定为1,计算出实验组SMS的相对活
性(图3)。

图3C结果显示,Huh7-tTA细胞SMS酶活性与野生型 Huh7细胞差异无统计学意义,提示调控质粒(tTA)导入不影响细胞SMS酶活性。

Dox 100 ng/mL 时细胞SMS活性与Huh7-tTA差异无统计学意义(图3A、3B)表明Dox 100
ng/mL剂量可抑制导入SMS-FLAG的表达。

为了与后续研究一致,本实验采用Huh7-tTA作为实验对照组。

流行病调查显示,人血浆SM水平和 SM/PC比例升高是AS独立危险因子[2],因此定量研究SM和AS的关系显得很重要,但利用一般的高表达体系只能使得SMS的表达出现有和无的区别,不能精确显示不同水平SMS表达对AS的影响,而利用Tet-Off表达体系则可精确研究SMS的表达量和AS的关系,同时由于对SMS表达调控所用的Dox剂量很小,对细胞的毒性非常低[1]。

Tet-Off表达调控系统不但可用于细胞水平研究,还可用于动物水平的研究。

秦鑫添等[9]利用 Tet-Off系统在体外和体内都可以迅速、有效地调控人IFN-γ基因在小鼠骨髓基质细胞(MSCs)中的表达,而且调控是可逆的,且在体内外对细胞的毒性都非常低,这为Tet-Off表达调控系统应用于基因治疗的研究提供了可能。

本实验室董继斌博士等[8]利用腺病毒介导ApoE基因敲除小鼠肝脏过表达SMS2,结果显示与空白对照相比SMS过表达ApoE基因敲除小鼠具有更大的促进动脉粥样硬化斑块形成的潜能。

图1～3的结果从SMS mRNA、蛋白及酶活性水平均显示出导入SMS-FLA G表达受Dox剂量调控,呈现剂量效应。

这为后续研究SMS过表达与AS产生的定量关系打下了基础。

结论:(1)利用 Tet-Off体系成功构建 SMS高表达可调控 Huh7细胞;(2)调控质粒导入(Huh7-t TA)不影响野生型 Huh7细胞 SMS活性;(3)SMS细胞SMS高表达受Dox剂量调控。

因此该细胞模型可精确调控SMS在 Huh7细胞的高表达,这为研究SMS表达量和AS相关性的动态关系奠定了基础。

参考文献
[1] Sun Y,Chen X,Xiao D.Tetracycline-inducible expression systems:new strategies and practices in the transgenic mouse modeling[J].Acta Biochimicaet Biophysica Sinica,2007,39(4):235-246.
[2] Jiang XC,Paultre F,Pearson TA,et al.Plasma sphingomyelin level asa risk factor forcoronary artery disease[J].A rterioscler Thromb Vasc
Biol,2000,20(12):2 614-2 618.
[3] Futerman AH,Stieger B,Hubbard AL,et al.Sphingomyelin synthesis in rat liver occurs predominantly at the cis and medial cisternae of the Golgi apparatus[J].J Biol Chem,1990,265(15):8 650-8 657.
[4] Huitema K,van den Dikkenberg J,Brouwers J F,etal.Identification of a family of animal sphingomyelin synthases[J].EMBO J,2004,23(1):33-44. [5] Meng A,Luberto C,Meier AP,et al.Sphingomyelin synthase as a potential target for D609-induced apoptosis in U937 human monocytic leukemia cells[J].Ex p Cell Res,2004,292(2):385-392.
[6] Chen Z,Fitzgerald RL,Schonfeld G.Hypobetalipoproteinemic mice with a targeted apolipoprotein(Apo)B-27.6-specifying mutation[J].J Biol Chem,2002,277(6):14 135-1 4145.
[7] Lewis GF,Rader DJ.New insights into the regulation of HDL metabolism and reverse cholesterol transport[J].Cir Res,2005,96(12):1 221-1 232. [8] Dong JB,Wu MP,Jiang XC,etal.Adenovirus-mediated over expression of sphingomyelin synthases 1 and 2 increases the atherogenic potential in mice[J].J Lipid Res,2006,47:1 307-1 314.
[9] 秦鑫添,吕跃,谭银多,等.Tet-Off系统对小鼠骨髓基质细胞中人IFN-γ基因表达
的调控作用[J].癌症,2008,27(1):46-51.。