第三章蛋白质化学

第三章蛋白质化学
生命是蛋白体的存在方式，这种存在方式本质上就在于这些蛋白体的化学组成部分的不断自我更新。

恩格斯《反杜林论》1878
学习要求：
1. 了解蛋白质生物功能、分类。

2. 了解氨基酸分类、结构，掌握其重要化学反
应和分离、分析方法，重点弄清楚它的两性
性质,pI和 Pk。

3. 掌握蛋白质的一级结构及其序列分析方法。

掌握蛋白质二、三和四级结构的基本概念。

4. 了解蛋白质的重要理化性质。

5. 了解蛋白质分离、纯化方法及其理论依据。

一、蛋白质概述
1、概念
蛋白质（protein):
是由20种L-α-氨基酸按一定的序列通过酰胺键（肽键）缩合而成的，具较稳定构象并具一定生物功能的生物大分子。

2、蛋白质的化学组成
⑴元素组成：蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、氧外，还有氮和少量的硫。

某些蛋白质还含有其他一些元素，主要是磷、铁、碘、钼、锌和铜等。

这些元素在蛋白质中的组成百分比约为：
碳 50％-55%
氢 6.5-7.3％
氧 19-24％
氮 16%
硫 0-3％
其他微量
蛋白质的含氮量
大多数蛋白质的含氮量接近于16%，这是蛋白质元素组成的一个特点，也是凯氏（Kjedahl）定氮法测定蛋白质含量的计算基础。

所以，可以根据生物样品中的含氮量来计算蛋白质的大概含量：
样品中蛋白质含量=蛋白氮×6.25
6.25为蛋白质系数，即1克氮所代表的蛋白质量（克数）
⑵分子组成：
经酸、碱和酶处理蛋白质，使其彻底水解得到产物为氨基酸，组成蛋白质的常见20种氨基酸中除脯氨酸外，均为α-氨基酸：
C O O H
H2N
C H
R
3、蛋白质的大小与分子量
⏹蛋白质是分子量很大的生物分子。

对任一种给定的蛋白质来说，它的所有分子在氨
基酸的组成和顺序以及肽链的长度方面都应该是相同的，即所谓均一的蛋白质。

⏹蛋白质分子量的变化范围很大，从大约6000到1000000道尔顿（Da）或更大。

⏹某些蛋白质是由两个或更多个蛋白质亚基(多肽链)通过非共价结合而成的，称寡聚
蛋白质。

有些寡聚蛋白质的分子量可高达数百万甚至数千万。

（TMV：4x107）
1 D = 1.66033 10-27 Kg
⏹对于只含有多肽链的简单蛋白质：
⏹氨基酸残基的数目=蛋白质的分子量 / 110
（氨基酸残基平均分子量 110）
4、蛋白质的分类
分类原则：按分子形状、分子组成、溶解度、生物功能
⑴按分子形状：球状蛋白和纤维状蛋白；
⑵按分子组成：简单蛋白和结合蛋白；
⑶按溶解度：清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇
溶蛋白、精蛋白、组蛋白、硬蛋白等。

⑷按生物功能：酶、运输蛋白、营养和储存蛋白、运动蛋白、结构蛋白和防御蛋白
5、蛋白质的生物学功能
⑴催化作用：几乎所有的酶都是蛋白质。

⑵生物体的结构成分。

⑶运输和储存。

⑷运动作用：动物的肌肉收缩、细菌的鞭毛运动。

⑸免疫保护作用。

⑹激素作用：胰岛素等。

⑺接受和传递信息的受体：受体蛋白，⑻控制细胞生长、分化：生长因子、阻遏蛋白。

⑼毒蛋白：植物、微生物、昆虫所分泌。

⑽许多蛋白在凝血作用、通透作用、营养作用、记忆活动等方面起重要作用。

6、蛋白质的水解
蛋白质和多肽的肽键与一般的酰胺键一样可以被酸碱或蛋白酶催化水解，酸或碱能够将多肽完全水解，酶水解一般是部分水解.
完全水解得到各种氨基酸的混合物，部分水解通常得到多肽片段。

所以，氨基酸是蛋白质的基本结构单元。

大多数的蛋白质都是由20种氨基酸组成。

这20种氨基酸被称为基本氨基酸。

二、蛋白质的基本结构单位—氨基酸
（amino acid）
⏹㈠氨基酸的结构
⏹㈡氨基酸的种类及结构
⏹㈢氨基酸的重要理化性质
⏹氨基酸（amino acid, 简写aa)：
蛋白质的基本组成单位，是含氨基的羧酸。

⏹天然蛋白质由20种氨基酸组成。

1、氨基酸的结构
a、通式：
α-氨基酸中α碳原子为不对称碳原子（除甘氨酸）
由通式可得出：
1）组成蛋白质的aa都是α-氨基酸（除脯氨酸α—亚氨基酸外）；（2）不同aa仅R 链不同；（3）除甘氨酸外，其余aa的α-碳原子均为不对称碳原子。

2、α-氨基酸的构型：
构型：由于基团或原子在空间排列的不对称性而引起的光学活性立体结构称立体构型。

立体构型：氨基在左为L-型；氨基在右为D-型。

天然蛋白质中的aa均为L-型；两型aa 的生理功能不同。

3、α- 氨基酸具旋光性
左旋（-）：能使偏振光向左；右旋（+）：能使偏振光向右。

旋光特性表示：比旋光度[α]D ，L-氨基酸比旋光度见P76表3-7
构型与比旋光度无直接对应关系
⏹氨基酸的旋光性和旋光角度与R基团的性质及测定时溶液的pH有关；
⏹当某氨基酸以等量L、D型混合时，旋光抵消，称外消旋；
⏹化学合成所得氨基酸为D、L各半的混合物，称DL型，无旋光性，可用化学或生
化方法将二型分开，此时才表现出旋光性。

（二）氨基酸的种类及结构
1、根据是否组成蛋白质来分
①非极性R基团氨基酸（8种）：
丙氨酸（Ala）缬氨酸（Val）亮氨酸（Leu）异亮氨酸（Ile）脯氨酸（Pro）苯丙氨酸（Phe 色氨酸（Trp）甲硫氨酸（Met）
特点：不易溶于水
R基疏水性大小:Ala＜Met ＜Pro ＜Val ＜Leu＝Ile ＜Phe ＜Trp
这类氨基酸R基的疏水性，在维持蛋白质的三维结构中起着重要作用。

Pro是唯一的一种α-亚氨基酸，它在蛋白质空间结构中具有极重要的作用，一般出现在两段α-螺旋之间的拐角处.
②极性不带电荷R基团氨基酸（7种）：
甘氨酸（Gly）丝氨酸（Ser）苏氨酸（Thr）半胱氨酸（Cys）酪氨酸（Tyr）天冬酰胺（Asn）谷氨酰胺（Gln）
特点：侧链含极性基团，在生理条件下不解离，易溶于水，R侧链能与水形成氢键。

Gly是唯一不含手性碳原子的氨基酸，因此不具旋光性。

Cys中R含巯基（-SH），两个Cys的巯基氧化生成二硫键，二硫键在蛋白质的结构中具有
重要意义 Cys —s —s —Cys ③ R 基团带负电荷氨基酸：
天冬氨酸（Asp ）谷氨酸（Glu ）在生理条件下,侧链羧基完全解离，带负电荷。

为酸性氨基酸
④ R 基团带正电荷氨基酸：
赖氨酸（Lys ）精氨酸（Arg ）氨酸（His ）为碱性氨基酸，在生理条件下，侧链解离，带正电荷。

4、按人体是否可合成来分：
必需氨基酸：Lys Val Ile Leu phe Met Trp Thr 半必需氨基酸：Arg His 非必需氨基酸：其余氨基酸 5、蛋白质中几种重要的稀有氨基酸 在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸，通常
本氨基酸衍生而来的。

其中重要的有4-
羟基脯氨酸、 5-羟基赖氨酸、N-甲基赖氨酸、和3,5-二碘酪氨酸等。

这些不常见蛋白质氨基酸的结构如下。

6、非蛋白氨基酸
广泛存在于各种细胞和组织中，呈游离或结 合态，但并不存在蛋白质中的一类氨基酸，大部 也是蛋白质氨基酸的衍生物。

结 构 特 点：（1） 大多是L-型α–氨基酸的衍生物，L-瓜氨酸（Cit ） 、L-鸟 氨酸（Orn ）（2）β-、γ-、δ-氨基酸 β-Ala 、 γ-氨基丁酸。

（3）D-型氨基酸 D-Glu 、D-Ala （肽聚糖中） D-Phe （短杆菌肽S
非蛋白氨基酸存在的意义：
1.作为细菌细胞壁中肽聚糖的组分：D-Glu D-Ala
2.作为一些重要代谢物的前体或中间体: -丙氨酸（VB3）、鸟氨酸（Orn ）、胍氨酸（Cit ）(尿素)
3.作为神经传导的化学物质：γ-氨基丁酸
4.有些氨基酸只作为一种N 素的转运和贮藏载体（刀豆氨酸）
5.杀虫防御作用:如种子中高浓度的刀豆氨酸和5-羟色氨酸能防止毛虫的危害，高精氨酸能抑制细菌的生长。

（三）氨基酸的理化性质 1. 氨基酸的一般物理性质
⑴ 氨基酸的旋光性：除甘氨酸外，氨基酸含有一个手性α-碳原子，因此都具有旋光性。

比旋光度是氨基酸的重要物理常数之一，是鉴别各种氨基酸的重要依据。

旋光性：旋光物质使平面偏振光的偏振面发生旋转的能力。

使偏振面向右旋的，称右旋光物
质，记为“+”，使偏振面向左旋的，称左旋光物质，记为“-”。

氨基酸的旋光性是由它们的结构决定的。

除甘氨酸外，其它氨基酸的α-C原子都与四个不同的原子和基团连接，因而是不对称C原子。

手性中心（chiral center）：当一个C原子有四个不同的取代基同它连接形成一个不对称碳原子时，这个碳原子就是一个不对称中心或称做手性中心。

⑵氨基酸的光吸收
构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(<220nm)均有光吸收。

在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力,因其含有苯环共轭双键的R侧链。

酪氨酸的max＝275nm，苯丙氨酸的max＝257nm，色氨酸的max ＝280nm。

所以，测样品280nm处的光吸收值，可知溶液中蛋白质浓度。

此法快速简便。

⑶高熔点
⑷一般均溶于水，溶于强酸、强碱；不溶于乙醚。

⑸氨基酸一般有味
2、两性解离与等电点（两性性质）：
（1）氨基酸为两性电解质：氨基酸在水溶液中或在晶
体状态时主要时以两性离子的形式存
在。

氨基酸在水中的两性离子既能像
酸一样放出质子，
也能像碱一样接受质子，氨基酸具有
酸碱性质，是一
类两性电解质。

（2）氨基酸解离方式取决于所处环境的pH：
在电场中，阳离子向负极移动；阴离子向阳极移动；调整pH，使氨基酸净电荷为零时，氨基酸既不向阳极也不向阴极移动。

（3）等电点（isoelectric point, 缩写为pI）：特点：净电荷数等于零，在电场中不移动；此时氨基酸的溶解度最小。

等电点相当于该氨基酸（aa）两性离子状态两侧基团pK值之和的一半。

A、对侧链R基不解离的中性氨基酸：
pI=1/2（p K1+ p K2）
即：等电点pH值与离子浓度无关，只取决于兼性离子两侧基团的pK值。

氨基酸的解离常数可以用测定滴定曲线的实验方法求得。

当1mol的甘氨酸溶于1L水时，溶液的pH约为6，此时甘氨酸为兼性离子状态R+。

若用标准NaOH滴定，以加入的NaOH 摩尔数对pH作图，得滴定曲线B,在pH9.60处有一拐点（滴定中点)。

R+作为酸，由NH3+提供质子，逐渐变为R-,滴定中
点时有一半R+变为R-,即[R+]=[R-]，
则 K2 = [H+]pK2=pH(拐点处）pK2就是R+的
NH3+50%解离时溶液的pH值，K2就是此时溶液
的[H+]
若用HCl滴定，在pH2.34 处有一拐点，拐点处pH即为pK1。

R基不解离的氨基酸都有类似甘氨酸的滴定曲线。

氨基酸有时被用作缓冲剂，缓冲剂是当加入酸或碱时具有抗pH改变的溶液，缓冲剂起作用的pH范围称为缓冲范围，通常定义为pK+1至pK-1。

20种基本氨基酸中只有组氨酸的咪唑基的pK最接近生理pH值（游离氨基酸中为6.00，在多肽链中为7.35 ），是在生理pH条件下唯一具有缓冲能力的氨基酸。

（血红蛋白）
中性AA的等电点计算：
酸性AA的等电点计算：
碱性AA的等电点计算：
氨基酸的pI值等于该氨基酸的两性离子状态两侧的基团pK′值之和的二分之一。

1.当外液pH为某一pH值时，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-数目正好相等，净电荷为0。

这一pH值即为氨基酸的等电点，简称pI。

2.某氨基酸的等电点即为该氨基酸两性离子两边的pK值和的一半。

3.在氨基酸等电点以上任何pH，AA带净的负电荷，在电场中向阳极移动；在氨基酸等电点以下任何pH，AA带净的正电荷，在电场中向阴极移动。

4.在一定pH范围中，溶液的pH离AA等电点愈远，AA带净电荷愈多。

3、氨基酸的重要化学性质
亚硝酸盐反应
烃基化反应
酰化反应
脱氨基反应
西佛碱反应
侧链反应（-SH-OH等）
α-氨基参加的反应
1.与丹磺酰氯反应(与酰化试剂反应）
DNS + AA /多肽/蛋白DNS-AA /多肽/蛋白DNS-AA +游离AA （乙醚抽提，有荧光，纸电游，薄层层析鉴定）用途：可以用来鉴定多肽或蛋白质NH2末端氨基酸.
2、氨基酸与2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反应（sanger反应，烃基化反应）
+弱碱
DNP-AA(黄色)（二
硝基苯基氨基酸）+ HF DNFB 氨基酸
sanger反应鉴定多肽或蛋白质NH2末端氨基酸。

DNFB+多肽/蛋白/AA DNP-多肽/蛋白/AA+ HF DNP-AA
弱碱酸解
（有机相）+ 游离AA（水相）
3、氨基酸与苯异硫氰酸酯（PITC）的反应（Edman反应）
+弱碱
苯氨基硫甲酰氨
基酸（PTC）PITC
苯乙内酰硫脲衍生物(PTH-AA、无
色)（phenylisothiohydantion-AA
）
Edman反应鉴定多肽或蛋白质NH2末端氨基酸。

PITC+ 多肽/蛋白PTC—多肽/蛋白PTH-AA + 少一个
弱碱无水甲酸或HF
AA的多肽或蛋白
应用：多肽顺序自动分析仪
羧基参加的反应
叠氮反应:
酰化氨基酸甲酯 酰化氨基酸酰肼
酰化氨基酸叠氮
用途：活化羧基，用于肽的人工合成。

α-氨基和α-羧基共同参加的反应: 1. 与茚三酮的反应：
α-氨基酸与水合茚三酮溶液共热，引起aa 氧化脱氨、脱羧，水合茚三酮与反应产物（氨和还原型茚三酮）生成兰紫色化合物（Pro 和Hyp 呈黄色,440 nm ），色深与溶液中氨基浓度成正比。

应用：可定性或定量测定各种氨基酸。

a 、根据颜色深浅，在570（440）nm 处 测OD 值，可知样品中氨基酸含量。

b 、定量释放的CO2可用测压法测量，计算出参加反应的aa 量。

c 、蛋白质和多肽亦可反应，但灵敏度差。

2. 成肽反应：一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基可以合成肽，形成的键称肽键。

侧链基团的化学性质
对羟汞苯甲酸，作用：与金属离子的螯合性质可用于体内解毒
(1) 巯基（-SH ）的性质
-
OOC
CHCH 2
NH 3
+
-
OOC
CHCH 2NH 3
+
-
OOC CH NH 3+
CH 2
S
S
CH 2
NH 3+
CH -
OOC 胱氨酸，作用：氧化还原反应可使蛋白质分
子中二硫键形成或打开。

（2）羟基的性质 （3）咪唑基的性质
组氨酸含有咪唑基，它的pK2值为6.0，在生理条件下具有缓冲作用。

组氨酸中的咪唑基能够发生多种化学反应。

可以与A TP 发生磷酰化反应，形成磷酸组氨酸，从而使酶活化。

组氨酸的咪唑基也能发生烷基化反应。

生成烷基咪唑衍生物，并引起酶活性的降低或丧失。

作用：判断酶的活性中心。

4、氨基酸分离和分析
分配层析法和离子交换层析
a.分配层析法：一种溶质在两种互不相溶或几乎不相溶的溶剂中分配时,在一定温度和压力下平衡后,溶质在两相溶剂中的浓度比值,此比值称分配系数(Kd=CA/CB,各种aa 都有特定的分配系数，分配系数差异越大，愈容易分离）.
-
OOC CHCH 2S
NH 3+
Hg
+
COO
-
固定相：借助一定支持物（如：纤维素、淀粉、硅胶等亲水性不溶物质），以结合水为固定相。

流动相：以与水不溶的有机溶剂（如：酚、正丁醇）为流动相。

方法：流动相流过支持物，将分配系数不同的氨基酸分开，以茚三酮显色，形成色谱，扫描定量，或洗脱后比色定量。

纸层析：将氨基酸混合物点在滤纸的一角，然后在一个密闭的容器中用一个溶剂系统沿滤纸的方向进行展层，烘干滤纸后，旋转90 。

，再在另一个溶剂系统中进行第二向展层。

由于氨基酸在两个溶剂系统中具有不同的分配系数，因此就彼此分开，分布在滤纸的不同区域。

利用茚三酮显色，就得到了滤纸层析谱。

b.离子交换层析，原理：分离氨基酸时，用离子交换树脂作为支持物，利用离子交换树脂上的活性基团与溶液中的离子进行交换反应，由于各种离子交换能力不同，与树脂结合的牢固程度就不同，在洗脱过程中，各种离子以不同的速度移动，从而达到分离的目的。

这种分离主要与各种离子所带电荷有关，在电荷相同时，与极性，非极性有关。

阳离子交换树脂：活性基团是酸性的，如磺酸基-SO3H强酸型），羧基-COOH（弱酸型）。

阴离子交换树脂：活性基团是碱性的，如季胺基-N+(CH3)3OH- 。

高效液相色谱法，HPLC的特点: 固相支持物颗粒小，比表面积大；溶剂系统采用高压，流速快；适于各种类型的支持物的柱层析；HPLC分离氨基酸的灵敏度高，可达到10-12mol 水平。

电泳分离：带电颗粒在电场中移动。

氨基酸是两性离子化合物，在不同的pH条件下，携带不同的电荷。

当把氨基酸混合液点在用一定缓冲液浸湿的滤纸条上的时候，混合液中的各组分能根据它们所带电荷的种类和静电荷的多寡，在电场中以不同的速度向不同方向泳动，从而把它们分开。

氨基酸的制备和应用状况：
（二）氨基酸的用途
蛋白质的基本组成；对生物体具有其他特殊的生理作用，参与许多代谢作用，不少已用来治疗疾病；用于食品强化剂、调味剂、着色剂、甜味剂和增味剂;用于饲料添加剂；调节皮肤pH值和保护皮肤的功能。

三、肽（peptide）
1、肽与肽键
一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基之间失水形成的酰胺键称为肽键，所形成的化合物称为肽。

由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由多个氨基酸组成的肽则称为多肽。

组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基。

肽键（peptide bond）：肽平面，构成肽键的四个原子（C、O、N、H）和与之相连的两个α碳原子都处在同一个平面内，此刚性结构的平面称肽平面或酰氨平面。

肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。

肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。

肽键中的C-N键具有部分双键性质，
不能自由旋转。

在大多数情况下，C=O与
N-H或两个α-碳原子以反式结构存在。

2、肽链中AA的排列顺序和命名
在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序。

通常在多肽链的一端含有一个游离的α-氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一个游离的α-羧基，称为羧基端或C-端。

氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。

从肽链的N-末端开始，残基用酰称呼。

例如：丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸,
简写：Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu，书写时，通常把NH2末端AA残基放在左边，COOH末端AA 残基放在右边。

共价主链：肽链的骨干是由--N --Cα--C --序列重复排列而成，称为共价主链。

3、肽的重要理化性质
（1）.每种肽也有其晶体，晶体的熔点都很高,以偶极离子形式形成离子晶格。

（2）.在pH0-14范围内，肽的酸碱性质主要来自游离末端α-NH2和游离末端α-COOH以及侧链上可解离的基团。

（3）.每一种肽都有其相应的等电点，计算方法与AA一致且复杂。

4. 肽的化学反应：也能发生茚三酮反应、Sanger反应、DNS反应和Edman反应；还可发生双缩脲反应。

双缩脲反应:双缩脲是两分子的尿素经加热失去一分子
NH3而得到的产物。

含有两个以上肽键的多肽，具有
与双缩脲相似的结构特点，也能发生双缩脲反应，生成紫红色或蓝紫色络合物。

这是多肽定量测定的重要反应。

肽和蛋白质所特有而氨基酸所没有的颜色反应。

Cu2+ (碱性溶液)
5、天然存在的重要多肽
红紫色络合物在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。

但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。

这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽（active peptide）。

如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。

短杆菌肽S(环十肽)：由细菌分泌的多肽，有时也都含有D-氨基酸和一些非蛋白氨基酸。

如鸟氨酸（Ornithine, 缩写为Orn）。

能抗革兰氏阳性菌，对阴性细菌如绿脓杆菌、变性菌也有效。

临床上用于治疗和预防化脓性病症。

谷胱甘肽：存在与动、植物及微生物中。

1.参与体内氧化还原反应。

2.作为辅酶参与氧化还原反应保护巯基酶或含Cys的蛋白质中SH的还原性,防止氧化物积累。

四、蛋白质的分子结构
蛋白质的结构：
蛋白质是由一条或多条多肽(polypeptide)链以特殊方式结合而成的生物大分子。

蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。

蛋白质分子量变化范围很大, 从大约6000到1000000道尔顿甚至更大。

1. 蛋白质的一级结构
1) 定义——1969年，国际纯化学与应用化学委员会（IUPAC）规定：蛋白质的一级结构指蛋白质多肽链中AA的排列顺序，包括二硫键的位置。

其中最重要的是多肽链的氨基酸
顺序，它是蛋白质生物功能的基础。

牛胰核糖核酸酶（RNase）：一条多肽链，124AA残基组成，四个链内二硫键，分子量12600.它是测出一级结构的第一个酶分子。

胰岛素（insulin ）的一级结构：胰岛素的分子量为5734道尔顿，由51个氨基酸组成。

含A、B两条链，（A链：21肽，B链：30肽）。

A链和B链之间由两个链间二硫键（A7-B7,A20-B19)连接，A链本身第6位和第11位的2个Cys残基之间形成一个链内二硫键。

2) 蛋白质一级结构的测定
蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。

自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。

测定蛋白质氨基酸顺序的重要意义：测定蛋白质中的AA顺序，是走向阐明其生物功能基础中的很重要步骤。

顺序可以给出更多的信息。

为了了解多肽链折叠成三维构象所受到的限制，顺序测定是必须的。

AA顺序的改变可以导致异常的功能和疾病，所以顺序测定是分子病理学的一个重要部分。

蛋白质中的AA顺序很能指明它的进化史。

核苷酸序列分析的不足
(1) 测定蛋白质一级结构的要求
a、样品必需纯（>97%以上）；
b、知道蛋白质的分子量；可以预测AA数目，工作量大小。

c、知道蛋白质由几个亚基组成；
(2). 测定步骤
A.测定蛋白质分子中多肽链的数目和种类。

通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。

B.多肽链的拆分。

由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。

几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8 mol/L尿素或6 mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).
尿素和盐酸胍与蛋白质的可能作用方式：a.与肽链竞争氢键 b.增加非极性侧链在水中的溶解度。

C.二硫键的断裂
几条多肽链通过二硫键交联在一起。

可在8 mol/L尿素或6 mol/L盐酸胍存在下，用过量的β-巯基乙醇【SH-CH2-CH2-OH】(还原法)处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂（ICH2COOH）保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。

可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非共价力；应用过甲酸氧化法拆分多肽链间的二硫键。

D.分析多肽链的N-末端和C-末端。

多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。

在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。

N-端氨基酸分析：Sanger反应、Edman反应、与丹磺酰氯反应、氨肽酶法。

C-端氨基酸分析：
1、肼解法
此法是多肽链C-端氨基酸分析法。

多肽与肼
在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。

肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与
C-端氨基酸分离。

H2N C HC
R O
H N C HC
R O O
R n
C
C H
H N O H
n-1
N-端氨基酸 C-端氨基
O
R n
C
C H
H2N O H
H2N C HC
R O
N H N H2+
H+
22
氨基酸酰肼C-端氨基酸
2、羧肽酶(carboxypeptidase)法：
羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解AA。

根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。

目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。

羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。

E.多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。

多肽链断裂法：酶解法和化学法。

酶解法:胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶等
胰蛋白酶：
Trypsin ：R1=Lys和Arg
时（专一性较强，水解速度
快）。

R2=Pro 水解受抑。

糜蛋白酶：
或胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）：R1=Phe, Trp,Tyr时水解快; R1= Leu，Met和His 水解稍慢。

R2=Pro 水解受抑。

胃蛋白酶：
Pepsin：R1和R2＝Phe, Trp, Tyr; Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度较快。

R1=Pro 水解受抑。

嗜热菌蛋白酶：
thermolysin：R2=Phe, Trp, Tyr; Leu，Ile, Met以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。

R2=Pro或Gly 水解受抑。

R1或R3=Pro 水解受抑。

化学法：可获得较大的肽段
溴化氰(Cyanogen bromide)水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。

羟胺（NH2OH）：专一性断裂-Asn-Gly-之间的肽键。

也能部分裂解-Asn-Leu-之间的肽键以及-Asn-Ala-之间的肽键。

F.分离肽段测定每个肽段的氨基酸顺序。

G.确定肽段在多肽链中的次序。

利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。

H.确定原多肽链中二硫键的位置。

采用胃蛋白酶水解：切点多，二硫键稳定。

一般采用胃蛋白酶处理含有二硫键的多肽链(切点多；酸性环境下防止二硫键发生交换)。

将所得的肽段利用Brown及Hartlay的对角线电泳技术进行分离。

测定步骤：
1.测定蛋白质分子中多肽链的数目
2.拆分蛋白质分子中的多肽链
3.断裂多肽链内的二硫键
4.测定多肽链的氨基酸组成
5.分析多肽链的N末端和C末端
6.多肽链部分裂解成肽段
7.测定各个肽段的氨基酸顺序
8.确定肽段在多肽链中的顺序
9.确定多肽链中二硫键的位置
蛋白质的分类(回顾)：
分类原则：按分子形状、分子组成、溶解度、生物功能。