PCR操作步骤

PCR操作步骤
所需物品：2x Primestar（12.5μl）（已含DNA聚合酶，反应buffer，dNTP ），引物(1.25μl-正+1.25μl-反)，模板（1μl~1.5μl），无菌水（9μl）（补足体积）；冰盒，PCR仪，10ul、 20ul和100ul移液枪，PCR 管，PRC管板。

具体步骤：
1. 溶解引物：快速离心引物管，确保引物干粉离心至管底。

加一
定体积（根据管上数据2.3nmol则加23μlTris buffer）的10mM Tris buffer (pH=8.0)至引物管，配制100uM的引物保存液；然
后用10mM Tris buffer或无菌水稀释引物保存液至终浓度10uM （一般取2μL引物加18μL 10mM Tris，此为引物工作液）。

注：1）引物一般以干粉形式保存。

邮寄过程中，干粉可能会吸附在管壁和管盖内侧。

因此，收到引物后，请勿打开盖子，否则管内引物可能会散发到管外。

2）如果引物是Invitrogen合成的，则按照引物管上的’add H2O XXul’指示体积，加10mM Tris buffer至终浓度为100uM。

如果是其它公司的引物，请计算所需体积，配制100uM的引物。

3）配制引物保存液必须使用10mM Tris (pH=8，千万不能使用无菌水(pH=5~6)。

因为DNA在偏酸性溶液里面不稳定，在碱性环境中比较稳定。

1. PCR反应准备：primestar取1
2.5μL（25μL总体积），上下游
引物分别加1.25μL引物工作液（10uM），模板100ng（如果
质粒大小为4~8kb，如果模板是PCR产物，模板可做相应的调整，比如PCR产物为500bp，那么10~20ng/管就够了），加水补足25μL；加上述各物的顺序应按照大体积先加小体积后加的原则，液体触碰PCR管底部，如果管壁有残留应快速离心确
保所有溶液在底部。

注：primerstar必须分装成12.5ul/管，每个PCR反应只需一管。

可避免primestar的反复冻融，该过程极易使Primestar中的dNTP降解。

1. 设置PCR仪参数： 98℃预变性30s； [98℃变性10s； 55℃
，n（循环次数）一般为20-30次；
退火10s； 72℃延伸xs]
n
72℃总延伸5min；12℃无限时间。

注：1）退火温度视引物Tm值而定，一般我们都使用55℃。

如果引物的Tm值过低，可以尝试50℃退火温度，甚至更低，但同时扩增的特异性可能降低。

2）循环内的72℃延伸时间由扩增基因的长度而定。

Primestar的延伸速率为1000bp/min。

如果扩增片段为500bp，那么，30s的延伸时间足够。

3）最后的保温时间必须要在10℃以上，否则PCR仪容易坏。

尽量不要过夜PCR，如果实在需要，最好是当PCR结束后请别人帮你拿出你的样品，并放置-20℃，同时关闭PCR仪。

4）文库的第一轮PCR（含有突变的小片段）和非文库扩增，20 cycles 足够，文库的第二轮PCR可以进行30 cycles
1. DNA电泳或将PCR 产物放在-20度保存。