一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA、慢病毒载体及其构建方法和应用[发明专利]

(19)国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202111535765.1
(22)申请日 2021.12.15
(71)申请人 徐州市中心医院
地址 221000 江苏省徐州市解放路199号
(72)发明人 孟箭　周霖　李欣然　顾徐嘉　
陈霖　
(74)专利代理机构 南京经纬专利商标代理有限
公司 32200
专利代理师 曹翠珍
(51)Int.Cl.
C12N 15/113(2010.01)
C12N 15/867(2006.01)
A61K 31/713(2006.01)
A61P 1/02(2006.01)
A61P 25/00(2006.01)
(54)发明名称
一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA、慢病毒
载体及其构建方法和应用
(57)摘要
本发明公开了一种敲低PXYLP1基因表达的
shRNA、慢病毒载体及其构建方法和应用，通过
RNA干扰靶点设计及双链DNA oligo制备，将双链
DNA oligo与线性化的载体相连，将连接产物转
化大肠杆菌感受态细胞进行阳性克隆，构建短发
夹RNA慢病毒载体，敲低TSCC内源性PXYLP1基因
的表达，抑制了TSCC细胞的增殖能力，诱导了
TSCC细胞的凋亡，
从而抑制体内肿瘤生长。

权利要求书1页 说明书10页序列表1页 附图9页CN 114457075 A 2022.05.10
C N 114457075
A
1.一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA，其特征在于，所述shRNA包括DNA oligo的正链和反链，所述正链为序列表SEQ ID NO.1所示的碱基序列，所述反链为序列表SEQ ID NO.2所示的碱基序列，所述的正链和反链退火，形成带粘性末端的双链DNA：
SEQ 1：
5’‑CCGGCCCGGTAAGAAACCAGTATCTCTCGAGAGATACTGGTTTCTTACCGGGTTTTTG ‑3’
SEQ 2：
5’‑AATTCAAAAACCCGGTAAGAAACCAGTATCTCTCGAGAGATACTGGTTTCTTACCGGG ‑3’。

2.根据权利要求1所述的一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA，其特征在于，所述shRNA干扰靶点为CGGTAAGAAACCAGTATCT。

3.一种权利要求1所述的敲低PXYLP1基因表达的shRNA的慢病毒载体，其特征在于，所述慢病毒载体由权利要求1合成的双链DNA克隆入慢病毒载体GV 115中制成。

4.一种权利要求3所述的慢病毒载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)针对RNA干扰靶点序列设计合成双链DNA oligo：合成权利要求1所述的DNA oligo的正链和反链，将合成的单链DNA oligo干粉溶解于退火缓冲液中，90℃水浴15min；自然冷却至室温后，形成带粘性末端的双链DNA；
2)线性化载体的制备：使用AgeI和EcoRI双酶切GV115载体使其线性化，37℃反应1h，切胶回收目的片段；
3)生成双链DNA oligo与线性化载体的连接产物：将步骤1)得到的双链DNA oligo与步骤2)得到的线性化载体于20μl反应体系中，16℃反应1h ‑3h，连接产物命名为psc54972；
4)克隆转化：将步骤3)连接产物转化进大肠杆菌感受态细胞，对阳性克隆进行PCR鉴定；
5)质粒抽提：将测序正确的菌液转接于培养基中，提取质粒，将质检合格的质粒转交下游平台进行病毒包装。

5.如权利要求1所述的一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA在制备舌鳞癌诊断、治疗和预后预测药物中的应用。

6.如权利要求2所述的一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA的慢病毒载体在制备舌鳞癌诊断、治疗和预后预测药物中的应用。

权　利　要　求　书1/1页CN 114457075 A
一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA、慢病毒载体及其构建方法
和应用
技术领域
[0001]本发明涉及癌症治疗领域，具体涉及短发夹RNA介导敲低舌鳞癌细胞PXYLP1的方法及其应用。

背景技术
[0002]舌鳞状细胞癌(TSCC)是常见的恶性肿瘤之一,具有高死亡率与发病率。

它的发展是一个涉及遗传改变和表观遗传修饰的多步骤过程。

TSCC是许多变量的致病因素，多种遗传改变和环境因素的积累，如烟草使用，饮酒，慢性炎症和人乳头瘤病毒(HPV)感染等，最近一些报道表明年轻成人的TSCC在发病率增加，特别是在女性中，远处转移率较高，预后较差。

因此，由不同风险因素引起的TSCC可能具有不同的分子基础，涉及细胞周期控制和衰老控制的丧失，细胞凋亡的失调，以及口腔扁平苔藓和白班的发生等方面。

[0003]目前化合物或天然提取物质在舌鳞状细胞癌的治疗中应用比较广泛，例如CN 110680815 A和CN 111773218 A，但是小干扰RNA生物药物在制备治疗舌鳞状细胞癌方面的应用较少，化疗药物副作用大，选择性差，靶向性较低，应用有局限性。

[0004]评价肿瘤生物学行为的主要指标有肿瘤细胞增殖、生长形成能力、凋亡等。

本研究通过敲低舌鳞癌细胞系内源性PXYLP1基因的表达，观察其对肿瘤细胞生物学行为的影响，为舌鳞癌患者的预后判断以及手术和靶向治疗方案提供参考。

探索无创、安全和便捷的方式检测特异性基因PXYLP1，有利于辅助舌鳞癌诊断、治疗和预后预测。

发明内容
[0005]针对上述存在的技术不足，本发明的目的是提供一种短发夹RNA介导敲低舌鳞癌细胞PXYLP1的方法，通过通过敲低舌鳞癌细胞系内源性PXYLP1基因的表达，以实现抑制肿瘤的作用。

[0006]为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
[0007]一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA，所述shRNA包括DNA oligo的正链和反链，所述正链为序列表SEQ ID NO.1所示的碱基序列，所述反链为序列表SEQ ID NO.2所示的碱基序列，所述的正链和反链退火，形成带粘性末端的双链DNA：
[0008]SEQ 1：
[0009]5’‑CCGGCCCGGTAAGAAACCAGTATCTCTCGAGAGATACTGGTTTCTTACCGGGTTTTTG‑3’[0010]SEQ 2：
[0011]5’‑AATTCAAAAACCCGGTAAGAAACCAGTATCTCTCGAGAGATACTGGTTTCTTACCGGG‑3’。

[0012]优选地，所述shRNA干扰靶点为CGGTAAGAAACCAGTATCT。

[0013]本发明的第二个目的是提供一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA的慢病毒载体，所述慢病毒载体由上述合成的双链DNA克隆入慢病毒载体GV 115中制成。

[0014]本发明的第三个目的是提供所述的慢病毒载体的构建方法，包括以下步骤：
[0015]1)针对RNA干扰靶点序列设计合成双链DNA oligo：合成权利要求1所述的DNA oligo的正链和反链，将合成的单链DNA oligo干粉溶解于退火缓冲液中，90℃水浴15min；自然冷却至室温后，形成带粘性末端的双链DNA；
[0016]2)线性化载体的制备：使用AgeI和EcoRI双酶切GV115载体使其线性化，37℃反应1h，切胶回收目的片段；
[0017]3)生成双链DNA oligo与线性化载体的连接产物：将步骤1)得到的双链DNA oligo 与步骤2)得到的线性化载体于20μl反应体系中，16℃反应1h‑3h，连接产物命名为psc54972；
[0018]4)克隆转化：将步骤3)连接产物转化进大肠杆菌感受态细胞，对阳性克隆进行PCR 鉴定；
[0019]5)质粒抽提：将测序正确的菌液转接于培养基中，提取质粒，将质检合格的质粒转交下游平台进行病毒包装。

[0020]本发明的第四个目的是提供所述的一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA在制备舌鳞癌诊断、治疗和预后预测药物中的应用。

[0021]本发明的第四个目的是提供一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA的慢病毒载体在制备舌鳞癌诊断、治疗和预后预测药物中的应用。

[0022]本发明的有益效果在于：本研究通过敲低舌鳞癌细胞系内源性PXYLP1基因的表达，包括针对PXYLP1基因的干扰靶点序列，包装构建慢病毒，对PXYLP1基因进行敲减后，发现显著影响舌鳞癌细胞CAL‑27细胞和SCC‑25细胞的增殖，影响细胞生长形成能力，并促进细胞的凋亡，并通过体内实验进行了验证，表明该基因可能调控肿瘤的发生发展，可能成为舌鳞癌的一个潜在治疗靶点，为舌鳞癌患者的预后判断以及手术和靶向治疗方案提供参考。

探索无创、安全和便捷的方式检测特异性基因PXYLP1，有利于辅助舌鳞癌诊断、治疗和预后预测。

附图说明
[0023]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0024]图1为为线粒化载体的琼脂糖凝胶电泳图；其中泳道1：1kb Marker：从上至下依次为10kb，8kb，6kb，5kb，4kb，3.5kb，3kb，2.5kb，2kb，1.5kb，1kb，750bp，500bp，250bp；泳道2：Age I和EcoR I双酶切线性化后的载体质粒；泳道3：没有酶切的载体质粒；
[0025]图2为RNA干扰载体构建及阳性克隆鉴定示意图；
[0026]图3为琼脂糖凝胶电泳检测条带；其中泳道1：阴性对照(ddH2O)，排除系统中外源核酸污染导致假阳性结果；泳道2：自连对照(空载体自连对照组)；泳道3：250bp Marker：从上至下依次为5kb，3kb，2kb，1.5kb，1kb，750bp，500bp，250bp，100bp；泳道4‑8：单克隆psc54972‑1,2,3,4,5；
[0027]图4为PXYLP1在癌组织和癌旁组织中的表达差异图；
[0028]图5为PXYLP1在SCC‑25细胞和CAL‑27细胞中mRNA的表达丰度；
[0029]图6为CAL‑27细胞被成功地感染了表达PXYLP1 shRNA或对照shRNA psc3741的慢病毒；
[0030]图7为SCC‑25细胞被成功地感染了表达PXYLP1 shRNA或对照shRNA psc3741的慢病毒；
[0031]图8为mRNA水平PXYLP1基因消减效率示意图，其中左侧为CAL‑27细胞结果，右侧为SCC‑25细胞结果；
[0032]图9为靶点降低PXYLP1基因蛋白水平表达，左侧为CAL‑27细胞结果，右侧为SCC‑25细胞结果；
[0033]图10为使用FACS细胞凋亡实验来评估shPXYLP1组CAL‑27细胞的凋亡情况结果图；[0034]图11为使用FACS细胞凋亡实验来评估shPXYLP1组SCC‑25细胞的凋亡情况结果图；[0035]图12为敲减PXYLP1后CAL‑27细胞周期的变化结果图；
[0036]图13为敲减PXYLP1后SCC‑25细胞周期的变化结果图；
[0037]图14为敲减PXYLP1后CAL‑27细胞的增殖速率变化Celigo细胞计数结果显示图；[0038]图15为敲减PXYLP1后SCC‑25细胞的增殖速率变化Celigo细胞计数结果显示图；[0039]图16为敲减PXYLP1后CAL‑27细胞的增殖速率变化MTT检测结果显示显示图；[0040]图17为敲减PXYLP1后SCC‑25细胞的增殖速率变化MTT检测结果显示显示图；[0041]图18为敲减PXYLP1后，实验组(KD)和对照组(NC)CAL‑27异种移植物的肿瘤大小和重量变化对比图；
[0042]图19为敲减PXYLP1后，实验组(KD)和对照组(NC)动物活体成像实验显示对比图。

具体实施方式
[0043]下面结合具体实例对本发明的发明方法进行详细描述和说明。

其内容是对本发明的解释而非限定本发明的保护范围。

[0044]我们的研究发现设计针对PXYLP1基因的干扰靶点序列，包装构建慢病毒，对PXYLP1基因进行敲减后，会显著影响舌鳞癌细胞CAL‑27细胞和SCC‑25细胞的增殖，影响细胞生长形成能力，并促进细胞的凋亡，并通过体内实验进行了验证。

表明该基因可能调控肿瘤的发生发展，可能成为舌鳞癌的一个潜在治疗靶点。

[0045](一)实验方法
[0046]1、基因信息
[0047]在线资源TCGA数据库(/)用于生成舌鳞癌中癌与癌旁组织样本中PXYLP1表达差异。

[0048]2、细胞系和细胞培养
[0049]CAL‑27和SCC‑25TSCC细胞系购自中国科学院(中国上海)，两种细胞系均在液氮罐中取出进行复苏，在补充有10％胎牛血清(FBS)，100U/mL青霉素和100μg/100mL链霉素的
的潮湿气氛中温育。

Western Blot外源验RPMI 1640培养基中培养，并在37℃下在含5％CO
2
证靶点有效性。

[0050]3、RNA干扰靶点设计及双链DNA oligo制备
[0051] 3.1 RNA干扰靶点设计
[0052]根据RNA干扰序列设计原则，以PXYLP1基因为模板，设计多个19‑21nt RNA干扰靶
点序列。

经设计软件评估测定后，选取以下序列作为干扰靶点。

[0053]
[0054] 3.2 DNA oligo序列合成
[0055]根据已选靶点序列设计shRNA干扰序列，并在两端添加合适的限制性内切酶酶切位点以完成载体构建。

除此之外，在正链3’端添加TTTTT终止信号,而反链5’端添加终止信号互补序列。

设计完成后送捷瑞公司合成单链DNA oligo。

[0056]
[0057]＊CCGG：AgeI酶切位点；AATTC：EcoRI酶切位点；G：EcoRI酶切位点互补序列。

[0058] 3.3.双链DNA oligo制备
[0059]将合成的单链DNA oligo干粉溶解于退火缓冲液中(终浓度20μM)，90℃水浴15min。

自然冷却至室温后，形成带粘性末端的双链。

[0060]4、线性化载体制备
[0061]按照NEB说明书配制50μl反应体系，使用AgeI和EcoRI双酶切GV115载体使其线性化。

[0062]
[0063]37℃(最适温度)反应1h，之后切胶回收目的片段。

线粒化载体的琼脂糖凝胶电泳图如图1所示。

[0064]5、RNA干扰慢病毒载体构建
[0065] 5.1连接
[0066]按照Fermentas T4 DNA Ligase说明书配制20μl反应体系，将双链DNA oligo与线性化的载体相连。

[0067]
[0068]于16℃反应1h‑3h，连接产物命名为psc54972，之后进行转化实验。

[0069] 5.2转化
[0070]将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，详细操作步骤如下：
[0071]1)将10μl连接产物psc54972加入到100μl大肠杆菌感受态细胞中，冰浴30min。

[0072]2)42℃热激90sec，冰浴2min。

[0073]3)加入500μL无抗生素的LB液体培养基，200rpm于37℃摇床震荡培养1h。

[0074]4)取150μl菌液均匀涂抹在含有Amp的LB固体培养基上，于37℃培养箱中过夜培养。

[0075] 5.3阳性克隆的PCR鉴定
[0076] 5.3.1 RNA干扰载体构建及阳性克隆鉴定示意图如图2所示。

[0077] 5.3.2引物
[0078]
[0079] 5.3.3 PCR扩增
[0080]按下表配制20μl PCR反应体系，用无菌枪头挑取单个菌落为模板，进行PCR扩增，反应条件为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，22次循环；72℃5min。

PCR结束后，取5μl 产物，1％琼脂糖凝胶电泳检测条带。

琼脂糖凝胶电泳图如图3所示。

[0081]
[0082]PCR条带大小
[0083]连接入shRNA片段的阳性克隆PCR片段大小为：341bp；
[0084]没有连接入shRNA片段的空载体克隆PCR片段大小为：307bp。

[0085]由此判断psc54972‑1,2,4为阳性克隆，保存鉴定结果正确的克隆，并进行测序。

[0086] 5.4阳性克隆测序结果分析
[0087]以鉴定引物‑F进行阳性克隆测序，挑选测序结果与目标序列完全一致的克隆用于下一步实验。

[0088]psc54972测序结果
[0089]
[0090]＊shRNA干扰序列插入片段用下划线标注，其中AgeI酶切位点被破坏。

[0091] 5.5质粒抽提
[0092]将测序正确的菌液转接于150ml含Amp抗生素的LB液体培养基中，37℃摇床震荡培养过夜。

按照EndoFree Maxi Plasmid Kit说明书提取质粒，质检合格的质粒进入下游流程。

[0093]详细操作步骤如下：
[0094]1)8000rpm离心4min收集菌体；
[0095]2)加入7ml P1，震荡混匀；
[0096]3)加入7ml P3，颠倒混匀6～8次，静置5min；
[0097]4)加入7ml P4，颠倒混匀6～8次，冰浴10min；
[0098]5)9000rpm离心10min，将上清转移到过滤器CS中，过滤后加入10ml异丙醇混匀；[0099]6)向吸附柱中加入2.5ml的平衡液BL，8000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将
柱子放回备用；
[0100]7)将上清分两次倒入吸附柱中，8000rpm离心2min，弃废液；
[0101]8)向吸附柱中加入10ml漂洗液PW(已加入无水乙醇)，相同转速离心2min，弃废液，重复该步骤一次；
[0102]9)向吸附柱中加入3ml无水乙醇，8000rpm离心2min，弃废液；
[0103]10)9500rpm空甩5min，除去残留的漂洗液；
[0104]11)将吸附柱转移至一新的白管中，在柱中心滴加800μl洗脱缓冲液TB(先预热)，室温放置5min，然后9500rpm离心2min；
[0105]12)将管中的洗脱液转移到一干净的1.5mlEP管中，‑20℃保存；
[0106]取样电泳，使用分光光度计(Thermo_Nanodrop 2000)测定质粒浓度，质检。

[0107]将质检合格的质粒转交下游平台进行病毒包装。

[0108]6、RNA提取和qPCR
[0109]按照制造商的方案，使用Trizol从TSCC细胞系中提取总RNA。

并根据制造商的说明书用M‑MLV RT合成cDNA其中反转录引物来自广州市锐博生物科技公司。

然后两步法进行Real‑Time PCR检测PXYLP1在CAL‑27细胞和SCC‑25细胞中mRNA的表达丰度，MicroRNA PCR 引物来自广州市锐博生物科技公司。

人内源性肌动蛋白(ACTB)用作内参基因对照和比较阈值循环法(2‑ΔCt)方法用于计算mRNA的相对表达水平。

在Stratagene Mx3000P上使用SYBR Green master mix进行qPCR。

[0110]引物信息：
[0111]
[0112]7、慢病毒转染细胞并通过qPCR和Western印迹测量PXYLP1 shRNA的干扰效率[0113]由GeneChem Co，Ltd(中国上海)构建并合成PXYLP1 shRNA干扰慢病毒载体。

PXYLP1 shRNA干扰靶序列是5'‑CGGTAAGAAACCAGTATCT‑3'(shPXYLP1)，并且使用5'‑TTCTCCGAACGTGTCACGT‑3'作为阴性对照(shCtrl)。

根据制造商的说明，通过实时PCR测定慢病毒滴度，并且用感染复数(MOI)为20的慢病毒载体转染到CAL‑27细胞和SCC‑25细胞中。

接种细胞(2×105个细胞/mL)置于6孔板上并孵育，成功感染的细胞为绿色荧光蛋白阳性，72h 后在荧光显微镜下观察，并使用定量实时PCR(qPCR)和Western Blot测定PXYLP1D shRNA的干扰效率。

检测蛋白敲减效率。

[0114]9、蛋白质印迹
[0115]用冰冷的PBS洗涤细胞两次，并用RIPA缓冲液裂解。

在浓度为10％SDS‑PAGE凝胶上分离含有30μg蛋白质的等份细胞裂解物，并在300mA恒流条件下电转150min，将蛋白转移到PVDF膜上。

将膜在含有5％脱脂牛奶的TBST缓冲液中封闭，并与Anti‑PXYLP1：1:500、Anti‑β‑actin；1:10000稀释过夜，然后与Anti‑Rabbit IgG：1:100000孵育。

使用ECL试剂盒结合X
光片使条带可视化。

[0116]10、Celigo细胞计数法检测细胞生长
[0117]用0.25％胰蛋白酶消化TSCC细胞以制备单细胞悬浮液，然后用血细胞计数器计数细胞。

将细胞(2×103个细胞/孔)接种到96孔板上，并在37℃，5％CO2培养箱中培养24小时。

从铺板后第二天开始，每天Celigo细胞计数器检测读板一次，连续5天检测读板，通过调整分析设置的输入参数，精确计算并统计分析具有绿色荧光的细胞数。

细胞计数倍数表示相对于第1天的平均值的每个时间点的细胞计数，表明细胞增殖的变化，对数据进行统计绘图，绘出5天的细胞增殖曲线。

[0118]11、MTT测定细胞活力
[0119]将慢病毒转染的TSCC细胞系中细胞(1.5×103个细胞/孔)接种到96孔板中并孵育24小时。

然后，向每个孔板中加入20μL的PBS中的3‑(4,5‑二甲基噻唑‑2‑基)‑2,5‑二苯基‑四唑溴化物。

20μL MTT在37℃下温育4小时后，弃去上清液，将沉淀物溶于100μl二甲基亚砜中。

使用酶标仪在490nm处测量每个孔的吸光度，OD490倍代表相对于第1天的平均值的每个时间点的OD值，表明细胞增殖的变化。

[0120]12、Annexin V‑APC单染法细胞凋亡检测
[0121]在转染72小时后将细胞接种(2×105个细胞/mL)到6孔板上并孵育至约85％汇合。

收获上清液和贴壁细胞，离心，用4℃预冷的PBS溶液洗涤，并以1×106个细胞/mL的密度在1×binding buffer中重悬。

按照制造商的说明使用膜联蛋白V凋亡检测试剂盒APC用Annexin V‑APC在室温下将细胞染色15分钟。

流式细胞术在Guava easyCyte HT系统上进行，并使用Guava InCyte软件(Millipore)进行分析。

[0122]13、细胞周期检测
[0123]在转染72小时后将细胞接种(2×105个细胞/mL)到6孔板上并孵育至约80％汇合。

收获上清液和贴壁细胞，离心，用4℃预冷的D‑Hanks溶液洗涤，离心，用4℃预冷的75％乙醇固定细胞1h，再次离心，去固定液，用4℃预冷的D‑Hanks溶液洗涤。

细胞染色液配制：40×PI 母液(2mg/mL)：100×RNase母液(10mg/mL)：1×D‑Hanks＝25：10：1000。

加入1ml的细胞染色液重悬，上机检测。

流式细胞术在Guava easyCyte HT系统上进行，并使用ModFit软件(Millipore)进行分析。

[0124]14、动物成瘤及活体成像
[0125]4周龄的雄性裸鼠购自上海凌昌生物科技有限公司。

在特定无菌条件下饲养，在研究期间，动物可免费获得高压灭菌食品和水。

分为两组，实验组(KD)和对照组(NC)，将1×107shPXYLP1(KD)或shCtrl(NC)细胞(CAL‑27)皮下植入每只小鼠的右侧腋下，30天后开始收集数据，称取裸鼠体重，测量肿瘤的长径和短径，然后每3‑4天测量一次，共10次。

结束前，对小鼠进行活体成像,先按10ul/g剂量腹腔注射D‑Luciferinn(15mg/mL)。

15分钟后，通过腹腔注射剂量为10ul/g的0.7％戊巴比妥钠麻醉动物。

数分钟后待动物麻醉，将其放置于活体成像仪下进行成像,观察荧光,保存数据。

固定小鼠，用医用剪刀和镊子取出肿瘤组织，并称重，用5‑0针缝合肌肉层和皮肤层，用碘伏擦拭消毒。

之后，通过过量注射2％戊巴比妥钠(0.5ml)对实验动物实施安乐死。

在他们完全失去知觉后，再进行颈椎脱臼确认死亡。

[0126](二)实验结果
[0127]1、PXYLP1在HNSCC组织中过表达
[0128]在我们的调查中，P X Y L P1表达数据来自在线T C G A数据库(h t t p s:// /,访问日期2021年7月10日)。

TCGA数据库现存528例头颈部肿瘤的样本，其中包含成对样本RNAseq数据的舌鳞癌样本一共15例。

结果显示，该基因在TCGA数据库舌鳞癌中癌与癌旁组织样本的表达存在明显差异(如下表)。

折线图更加直观的PXYLP1在TCGA RNA‑seq各个样本中的原始数据的差异表达(图4)。

[0129]
[0130]2、PXYLP1基因在舌鳞癌细胞中表达
[0131]用ACTB做内参作标准化对照，使用real‑time quantitative PCR的方法评估PXYLP1，在SCC‑25细胞和CAL‑27细胞中mRNA的表达丰度如图5所示。

[0132]3、PXYLP1 shRNA慢病毒抑制PXYLP1mRNA和蛋白质表达
[0133]为了研究PXYLP1的潜在作用，我们进行shRNA干扰以敲低CAL‑27细胞和SCC‑25细胞中的PXYLP1。

CAL‑27细胞(如图6)和SCC‑25细胞(图7)被成功地感染了表达PXYLP1 shRNA 或对照shRNA psc3741的慢病毒。

通过qPCR和Western印迹测量PXYLP1 shRNA的干扰效率。

如图8所示，与阴性对照细胞(shCtrl)相比PXYLP1的shRNA(shPXYLP1)细胞系，mRNA表达量受到抑制(P<0.05)，其中CAL‑27细胞敲减效率达到65.1％，SCC‑25细胞敲减效率达到82.3％。

此外，蛋白质印迹结果表明(图9)，在CAL‑27细胞和SCC‑2细胞中shRNA介导的敲低后，PXYLP1的蛋白质水平显着降低，靶点对PXYLP1基因的内源表达在蛋白质水平有显著的敲减作用，是有效靶点。

[0134]4、PXYLP1的敲减诱导了TSCC细胞的凋亡
[0135]为了研究PXYLP1是否涉及TSCC细胞系的调节凋亡能力，使用FACS细胞凋亡实验来评估shPXYLP1组舌鳞癌细胞的凋亡情况。

结果表明，shPXYLP1组细胞凋亡率明显比shCtrl 组细胞更高(P<0.05，图10和图11)，表明PXYLP1基因与CAL‑27细胞和SCC‑25细胞的凋亡显著相关(P<0.05)。

[0136]5、PXYLP1的敲减影响细胞周期
[0137]shRNA慢病毒感染5天后，CAL27细胞实验组处于S期的细胞减少(P<0.05)，处于G1期的细胞增多(P<0.05)，处于G2/M期的细胞减少(P<0.05)；SCC‑25细胞实验组处于S期的细胞减少(P<0.05)，处于G1期的细胞增多(P<0.05)，处于G2/M期的细胞减少(P<0.05)，提示PXYLP1基因与CAL27、SCC‑25细胞的周期显著相关(图12和图13)。

[0138]6、PXYLP1的敲减抑制了TSCC细胞的增殖能力
[0139]为了评估PXYLP1在TSCC增殖中的作用，在转染培养后5天，连续5天对shPXYLP1组和shCtrl组的舌鳞癌细胞(CAL‑27细胞和SCC‑25细胞)进行Celigo和MTT检测。

Celigo细胞计数结果显示，shPXYLP1组的舌鳞癌细胞增殖速率明显低于阴性对照组(P<0.05)，特别是在第4天与第5天(图14和图15)。

MTT检测结果显示shPXYLP1组CAL27、SCC‑25细胞的增殖速率受到显著抑制(P<0.05)。

提示PXYLP1基因与CAL27、SCC‑25细胞的增殖能力显著相关(图16和图17)。

[0140]7、PXYLP1基因敲除抑制体内肿瘤生长
[0141]在异种移植小鼠中进一步检测到敲除PXYLP1对CAL‑27细胞的抑制作用。

与NC组相比，剔除PXYLP1后，KD组CAL‑27异种移植物的肿瘤大小和重量显著受到抑制(P<0.05)(图18)。

此外，动物活体成像实验显示KD组荧光表达低于NC组(P<0.05)(图19)。

因此，这与体外实验结果一致。

体内实验结果表明，敲除PXYLP1可抑制肿瘤生长。

[0142]以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表
<110> 徐州市中心医院
<120> 一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA、慢病毒载体及其构建方法和应用<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccggcccggt
aagaaaccag tatctctcga gagatactgg tttcttaccg ggtttttg 58<210> 2
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<400> 2
aattcaaaaa cccggtaaga aaccagtatc tctcgagaga tactggtttc ttaccggg 58
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