原创3：1.2 基因工程的基本操作程序

PCR的特点
PCR的基本原理
Taq
Taq
Taq
PCR反应9条5℃件
PCR过程 PCR的特点
50℃ Taq
72℃
PCR的基本原理
PPCCRR反过应程7条2℃件
PCR的特点
第2轮结束
PCR技术扩增与DNA复制的比较
PCR技术
DNA复制
相 原理
碱基互补配对
同 原料 点 条件
四种脱氧核苷酸 模板、能量、酶
2、获取方法： （1）自然界分离技术扩增 目的基因
（3）通过DNA合成仪构
探针
15N
15N
转基因生物
14N
的mRNA
14N
变性
（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法：抗原-抗体杂交
提取蛋白质
注射小鼠 体内
小鼠产生 免疫
从小鼠血 管抽出血 液分离出 抗体
抗原
抗体
出现 杂交带
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用_同__一__种__限__制__酶__切断目的基因， 使其产生_相__同__的__黏__性__末。端
将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量 _D_N__A_连__接__酶__，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）
2、基因表达载体的组成： 启动子+目的基因+终止子+标记基因
它们各自的作用 是什么?
（2）操作程序:
3.将目的基因导入微生物细胞
常用法：Ca2+处理 常用菌：大肠杆菌
过程：
Ca2+处理大 肠杆菌
感受态细 胞
表达载体与 感受态细胞
混合
感受态细 胞吸收 DNA
四、目的基因的检测与鉴定
检测: 是否插入目的基因 是否转录 是否翻译
鉴定: 分子水平鉴定 个体生物学水平鉴定
1.检测 （1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了 目的基因
④结果：使目的基因的片段在短时间内大量扩增
⑤过程：变性、退火、延伸三步
➢变性：加热至90～ 95℃双链DNA解链 成为单链DNA
➢退火：冷却至55～ 60℃部分引物与模 板的单链DNA的特 定互补部位相配对 和结合
变性
➢延伸：加热至70～ 75℃以目的基因为 模板，合成互补的 退火 新DNA链
延伸
思考 编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞 与真核细胞基因结构一样长吗？Ⅲ.基因的构建方法 ①：直接分离法(鸟枪法)
多用于原核合成DNA法
上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？
鸟枪法
优点
操作简便 广泛使用
缺点
工作量大，盲目，分 离出来的有时并非一 个基因
解旋 不 方式
DNA在高温 下变性解旋
解旋酶催化
同 场所
体外复制
细胞核内
点 酶 热稳定的DNA聚合酶 细胞内的DNA聚合酶
结果 大量的DNA片段 形成整个DNA分子
二、基因表达载体的构建 —— 核心
1.目的:
2.过程: 用一定的__限__制__酶___切割质粒，使 其出现一个切口，露出_黏__性__末__端___。
反转录法
专一性强
操作过程麻烦， mRNA很不稳定，要 求的技术条件较高
根据已知氨基酸 合成DNA法
专一性最强
仅限于合成核苷酸对 据是什么？）
依据：目的基因的有关信息。
① 概念：PCR全称为_多__聚__酶__链__式__反__应__，是一项 在生物_体__外_复制_特__定__D_N__A_片__段___的核酸合成技术。
复习 基因工程的三种工具 限制酶切割产生的两种末端 DNA连接酶的两个种类 运输工具的常见种类
专题1 基因工程
基因工程的基本操作程序
（1）目的基因的获取 （2）基因表达载体的构建 （3）将目的基因导入受体细胞 （4）目的基因的检测与鉴定
一、目的基因的获取
1、目的基因： 主要指的是编码蛋白质的结构基因， 也可以是一些具有调控作用的因子。
（二）利用PCR技术扩增目的基因
模板DNA
95℃
PCR的基本原理
引物2
DNA引 物
PCR反应条件
PPCCRR过的6程特0点℃
引物1
PCR的基本原理
Taq酶 引物1
PCR反应条件
PCR过7程2℃
PCR的特点
DNA引物
引物2 Taq酶
PCR的基本原理
第1轮结束 第2轮开始
PPCCRR反过应程7条2℃件
注意事项
①运输载体与表达载体的区别： ②用到的工具酶： ③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少 ④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表 达载体的方式携带进去。
注意 ①运输载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和 复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上 增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构 ②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到 DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的 化学键都是磷酸二酯键 ③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少 ④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体 的方式携带进去。
三、将目的基因导入受体细胞
（一）转化：目的基因进入_受__体__细__胞__内，并且在 受体细 胞内维持_稳__定__和_表__达__的过程
将目的基因导入 植物细胞
农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法
（二） 方法
将目的基因导入
动物细胞
——显微注射法
将目的基因导入 微生物细胞
——钙离子处理
（1）农杆菌转化法 ①特点： 易感染双子叶植物和裸子植物，对 大多数单子叶植物没有感染能力
②原理：D_N__A_双__链__复__制
以_指__数__方式扩增，即__2_n_（n为扩增循 环的次数）
③前提条件：_已__知__基__因__的__核__苷__酸__序__列____； 原料：__模__板__D_N__A__、__D_N__A_引__物___ 、
_热__稳__定__D__N_A__聚__合__酶___(T__a_q_酶__)______、 _d_N__T_P_(_d_C__T_P_,d__A_T_P_,_d_G_T__P_,d_T__T_P_)___。
②原理： Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合 到受体细胞染色体的DNA上。 ③转化过程:
③转化过程:
Ti质粒
目的基 因
构建
表 达
转入
农 杆
导入
植 物
载
菌
细
体
胞
插入 植物细 胞染胞 （1）方法：
显微注射法（将基因表达载体提纯，用显微仪注 射到受精卵中）
方法： DNA分子杂交技术 基因探针： 放射性同位素等标记的含目的基因的
单链DNA分子
探针
15N
变性
15N
转基因生 物的DNA
14N 14N
变性
DNA分子杂交技术首先提取受体细胞中的DNA，
然后高温解成单链，再与同位素标记的DNA探针杂
交；
（2）检测目的基因是否转录出了mRNA 方法： 分子杂交技术