应用RAMP标记研究黑麦属遗传多样性

*基金项目:国家科技部基础研究快速反应支持项目、国家教育部重点项目和四川省青年基金资助项目。

尚海英：女，1978年生，硕士研究生，E-mail:〈sauhyshang@ 〉.**通讯作者。

Author for correspondence ，E-mail:〈grmb@ 〉.收稿日期：2002-12-02接受日期:2002-03-17
农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology 2003,11(6):566~571
·研究论文
应用RAMP 标记研究黑麦属遗传多样性*
尚海英
郑有良**
魏育明
吴卫颜泽洪
(四川农业大学小麦研究所，都江堰611830）
摘要:对黑麦属（
L.）10个野生居群和11个栽培居群共21份材料进行了RAMP(random amplified microsatellite
polymorphism )标记分析，结果表明，被测材料间RAMP 标记多态性较高。

80个RAMP 引物中，有41个引物（占50.5%）可扩增出清晰且具多态性的条带。

这41个引物共扩增出445条带，其中428条（占95.9%）具有多态性，每个引物可扩增出3~19条多态性带，平均10.4条。

RAMP 标记遗传相似性系数
（）变异范围为0.266~0.658，平均值为0.449。

RAMP 标记可将所有
21份黑麦材料完全区分开，聚类结果与材料的地理分布有一定关系，但与黑麦属传统的系统分类体系存在明显差异。

据此认为，RAMP 标记可以有效地评价黑麦属植物的遗传多样性，并为其物种亲缘关系的界定提供信息。

关键词:黑麦属；RAMP 标记；遗传多样性；聚类分析
Genetic Diversity of Based on RAMP Markers
Shang Haiying Zheng Youliang**Wei Yuming Wu Wei Yan Zehong
(Triticeae Research Institute,Sichuan Agricultural University ，Dujiangyan 611830,
China)diversity of 21accessions of
L.,
including 10wild and 11cultivated species or subspecies,
was
evaluated by using random amplified microsatellite polymorphism (RAMP)markers.Forty-one out of 80(50.5%)RAMP primers,which could amplify polymorphic bands clearly,were selected for the PCR amplification of genomic DNA.A total of 446bands were amplified from 41primers,while 428bands (about 95.9%)were polymorphic.Three to 19polymorphic bands could be amplified from each primer,with an average of 10.4bands.The RAMP-based genetic similarity ()among 21
accessions ranged from
0.266to 0.658,with a mean of 0.449.A high level of genetic variation was found between or within the wild populations and the
cultivars.Based on the
matrix,a dendrogram was constructed using the unweighted pair group method with arithmetic average
(UPGMA).All the 21accessions could be distinguished by RAMP markers.Clustering results showed that the genetic diversity of
based on RAMP markers were correlated with the geographical distribution.Six rye cultivars,originated respectively from Poland,Portugal,Maxico,Hungary,Armenia and Ukraine,were clustered into one group.The six countries are all located in the transition region between maritime temperate broad-leaved forest climate zone and continental temperate broad-leaved forest climate zone,with narrow latitude span.In comparison,the other five cultivars from countries scattering over the region with large latitude span were distributed within different groups or subgroups.Genetic relationships based on RAMP markers had much deviation from original taxonomy.Some subspecies of the same species were distributed within different groups,while some accessions of different species were closely clustered into one subgroup.
These results suggested that the RAMP markers could be used as an effective
molecular technique for detecting the genetic diversity among
and give some useful information for the phylogenic study
of
RAMP;genetic diversity;cluster analysis
RAMP （random amplified microsatellite poly-morphism ）是Wu 等[1，2]
1994年提出的一种分子标
第6期尚海英等：应用RAMP标记研究黑麦属遗传多样性
记技术。

与RAPD相比，RAMP更能真实反映物种间的亲缘关系[3，4]，而且更适合遗传背景尚不太清楚的物种[2~4]。

目前，RAMP仅见应用于转基因水稻[5]、杨树[5]和甘蔗[5，6]等的种质鉴定以及大麦[2，3，7]、桃[8]和鱼腥草[4]等植物资源的遗传多样性研究中。

黑麦属是小麦的三级基因源（tertiary gene pool）[5],是改良普通小麦产量、品质、抗病性和抗逆性的重要基因资源。

对黑麦属基因资源的研究和利用已经取得一定进展，但多局限于对栽培黑麦的开发利用。

黑麦属具有诸多不同的种或亚种，散布在世界各国不同的区域，蕴含着丰富的可利用的遗传变异。

因此，深入开拓和利用黑麦属基因资源是进一步扩大小麦遗传变异的有效途径之一。

本研究应用RAMP标记对黑麦属植物进行遗传多样性研究，以期为进一步挖掘和利用黑麦基因资源提供理论基础。

1材料和方法
1.1供试材料
共21份黑麦（
L.）材料（表1），包括3个种
11个亚种。

其中前10份为野
生黑麦材料，后11份为11个
国家的不同栽培黑麦品种。

所
有材料均由美国种质资源库
（germplasm resources infor-
mation network,GRIN）的
Bockelman博士提供。

1.2DNA提取
每份材料选取25~30个
植株上的新鲜叶片，于液氮冷
冻中混合研磨，然后随机取样
1~2g，置于50mL离心管中，
加入15mL65℃预热的2×
CTAB提取缓冲液(100
mmol/L Tris-HCl（pH8.0）,
10mmol/L EDTA,2%β-巯
基乙醇)，65℃水浴保温1~2
h，其间轻轻倒转数次，取出离
心管冷至室温。

加入等体积氯
仿/异戊醇（24/1V/V），混
匀。

冰浴30min后，3500
r/min离心15min。

取上清液
加入等体积的异丙醇沉淀DNA，70%乙醇冲洗2~3次，95%乙醇清洗1次，空气中干燥后用TE（Tris-EDTA）溶解备用。

1.3RAMP检测
首先利用5′端锚定的低聚核苷酸GC(CA)4和GT(CA)4与Operon公司生产的A和B组的40个十聚体随机引物组成80个引物组合对材料进行扩增筛选。

从中共筛选出扩增产物条带清晰的41个引物组合（表2）用于本实验。

PCR扩增参照Cheng等[6]的方法。

反应总体积25μL，其中含1U DNA 聚合酶（上海Promega）、1×buffer、1.5mmol/L MgCl2、200μmol/L dNTPs、200nmol/L引物和25 ng模板DNA。

PCR反应共进行45个循环，每循环94℃1min、45℃1min、72℃2min。

在MJ Research Inc.PTC-220型热循环仪上进行。

扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳分离。

溴化乙锭染色，凝胶成像仪Gel Doc2000TM(Bio-Rad)上观察摄相。

1.4数据处理
表1供实验材料
Table1Materials used in this study
编号保存号种名或亚种名品种来源
No.Accession No.Species or subspecies Cultivar name Resource/Country
1PI618662ssp.GRIN
2PI618666ssp.GRIN
3PI618667ssp.GRIN
4PI618669ssp.GRIN
5PI618673ssp.segetale GRIN
6PI573647ssp.GRIN
7PI618680GRIN
8PI445974ssp.GRIN
9PI326282ssp.GRIN
10PI568257GRIN
11PI168199ssp.4041GRIN,Turkey
12CIse20ssp.KINGⅡGRIN,Sweden
13CIse35ssp.Wrens GRIN,USA
14PI221478ssp.Jowder GRIN,Afghanistan 15PI240676ssp.PICO M.A.G.GRIN,Argentina
16PI323449ssp.Chrobre GRIN,Poland
17PI372117ssp.DESNIANKA2GRIN,Ukraine
18PI446025ssp.Balbo GRIN,Mexico
19PI535018ssp.103/1977GRIN,Portugal
20PI573634ssp.SORNOPOLEVAJA GRIN,Armenia
21PI290420ssp.Ovari GRIN,Hungary
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农业生物技术学报2003年
表2RAMP 引物组合及其扩增结果
Table 2RAMP primer combinations and the results of amplication
获得的RAMP 条带由Quality One 软件(Bio-Rad)分析计数。

每个样品的电泳条带按有或无记录,电泳条带存在时赋值为1,否则赋值为0。

按
Nei 和Li [9]的方法计算材料间遗传相似系数（）。

计算公式为：=/(+)，其中为材料和共有的扩增片段数目，为材料中出现的扩增片段数目。

根据值按不加权成对群算术平均法（unweighted pair group method with arithmetic means cluster analysis,UPGMA ）进行遗传相似性聚类。

统计分析在NTSYS-PC(version 2.10s)软件系统下[10]进行。

2结果和分析
2.1RAMP 多态性
利用能产生清晰扩增产物的41个RAMP 引物组合，对21份黑麦属材料进行了RAMP 多态性检测，扩增结果如图1。

从RAMP 扩增条带统计结果（表2）来看，在21份黑麦中，41个RAMP 标记共产生446条扩增带，每个引物能产生3~19条扩增带，平均10.7条。

在这446条扩增带中，能揭示材料间多态性的扩增带有428条，占95.9%；平均每个RAMP 标记能产生10.4条多态性带。

这些结果说明，RAMP 标记能够揭示材料间较高的多态性。

2.2遗传相似性系数
利用41个RAMP 引物在21份黑麦属植物中所获得的446条扩增带计算了材料间的遗传相似系
数（值）。

结果（表3）表明，所有黑麦材料间的值变化范围为0.266~0.658，平均值为0.449。

其中，10份不同野生类型黑麦间的值（表3左上角10×10矩阵）变化范围为0.320~0.658，平均值为
0.490，高于所有材料间的平均值。

栽培种内不同国家的黑麦材料间的值（表3右下角11×11矩
568
第6期尚海英等：
应用RAMP 标记研究黑麦属遗传多样性表3基于RAMP 标记的遗传相似系数
Table 3Genetic similarity(
)values based on RAMP markers
1~21同表1。

Notes of 1~21are the same as Table 1.
图1.GC(CA)4+OPA13扩增产物琼脂糖电泳图谱Fig 1.The amplification results of GC(CA)4+OPA13
1~21同表1；M 代表GeneRuler TM 100bp DNA 梯度。

Notes of 1~21are the same as Table 1;M stands for
GeneRuler TM 100bp DNA Ladder
.
阵）变化范围为0.315~0.598，平均值为0.456，略高
于所有材料间的平均
值。

野生类型和栽培类型之间的(表3左下角11×10矩阵)变化范围为0.266~0.585，平均值为0.429，明显低于所有黑麦材料间的平均值。

21份黑麦材料中，PI445974（
ssp.）和PI326282(
ssp.)之间的值最大，遗传相似程度
最高，遗传距离（GD =1原）最近；PI573647（
ssp.）和PI446025（ssp.）之间的
值最小，遗传相似程度最
低，遗传距离最远。

2.3聚类分析
利用RAMP 标记数据计算材料间的遗传相似
系数矩阵，采用UPGMA 法构建了黑麦间的遗传关
系聚类图（图2）。

结果表明，
利用RAMP 标记能将21份黑麦完全区分开。

以所有黑麦材料间平均值0.449为阈值，可以将所有供试材料划分为5类，其中PI573647和PI568257与其它材料间的遗传分
化均较大，分别单独聚为一类（第Ⅴ、Ⅳ类）
，PI323449、PI535018、PI446025、PI290420、PI573634和PI372117等6份栽培黑麦聚为一类（第Ⅲ类），PI168199、PI618669和PI618667等3份S.cereale
L.不同亚种材料聚为一类（第Ⅱ类），其余的10份材料聚为一类（第Ⅰ类）。

第Ⅰ类中又可划分出Ⅰa 、Ⅰb 和Ⅰc 三个亚类，Ⅰa 包括PI618662（ssp.）、PI618666（ssp.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
1 1.00020.6411.00030.4510.4131.00040.4720.4500.5081.000050.5890.5340.5140.5421.00060.4050.4600.3760.4460.4681.00070.5400.4820.5030.5820.6470.4401.00080.5250.4550.4400.5280.6120.4860.6361.00090.4800.4790.4340.5110.5850.4300.6040.6581.000
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农业生物技术学报2003年
①/cgi-bin/npgs/html/splist.pl?11022.2002-01-23.②http://pgrc3.agr.ca/cgi-bin/npgs/html/splist.pl?11022.2001-01-24
图2.RAMP 标记的遗
传聚类图Fig.2.A dendrogram of
generated from RAMP
markers
）和PI240676（ssp.）
等3个不同栽培黑麦亚种；
Ⅰc 包括CIse 35和PI221478两个栽培黑麦品种；Ⅰb 包括PI618673(ssp.)、PI618680（）、PI445974（ssp.）、PI326282(ssp.
)和CIse 20（ssp.），其
中PI445974和PI326282间的遗传分化最小，紧密地聚为一枝。

3讨论
3.1RAMP 在评价黑麦属遗传多样性中的有效性
RAMP 揭示的多态性很高[2~4,7,8]，Sanchez de la Hoz 等[2]和D ávila 等[3,7]在应用RAMP 标记对大麦进行的遗传多样性研究中，分别获得了58.4%、86.15%
和68.7%的多态性标记；
吴卫[4]在鱼腥草种质资源遗传多样性研究中获得的多态性水平高达97.7%；
Cheng 等[8]的报道中未见多态性水平的数据，
但也表明多态性很高。

本研究利用41个RAMP 引物组合对21份黑麦属材料进行RAMP 扩增，总共获得446条扩增带，428条多态性带，95.9%的扩增片段能够揭示材料间的遗传差异，说明RAMP 标记能揭示黑麦属材料间较高的多态性。

由此可见，RAMP 作为评价植物遗传资源遗传多样性的一种十分有效的分子标记技术，具有极其广泛的应用价值。

3.2黑麦属物种间的遗传关系
从材料间基于RAMP 标记数据的遗传相似系数矩阵可以看出，所有黑麦材料间的值均较低，变化范围为0.266~0.658，平均值为0.449。

栽培黑麦种
内的平均值为0.456，野生黑麦内部平均值为
0.490，而野生类型和栽培类型之间的平均
值只有0.429，变化范围为0.266~0.585。

这说明黑麦属物种间或物种内部均具有较大的遗传分化，而且栽培黑麦和
野生黑麦间的遗传差异很大，
明显高于二者内部的遗传差异。

聚类结果中，分别来自波兰、葡萄牙、墨西哥、匈牙利、亚美尼亚和乌克兰的6个黑麦品种聚为一类，其它5个分别来自美国、阿根廷、瑞典、阿富汗和
土耳其的品种的聚类相对分散。

从不同国家的地理分布来看，聚为一大类的6个品种所来源的国家，在地
理区划上虽然分属于中欧、
西欧、西亚和北美洲，但是其纬度跨越不大，均位于海洋性温带阔叶林气候向大陆性温带阔叶林气候过渡的地带，地形气候特点相近；其它5个国家分别位于北美洲、南美洲、北欧、西
亚和南欧，纬度跨越较大，
地理气候特点迥异。

据此认为，RAMP 的聚类结果与物种的地理分布有一定关系，这与D ávila 等[3]指出的RAMP 的聚类结果与材料的地理分布有关的结论相一致。

3.3黑麦属物种或亚种间的系统关系
目前，对黑麦属的分类仍存在不同主张。

综合国内外专家学者的研究结果[10~13]，并根据两大种质资源库GRIN 和PGRC 采用的一致的分类体系①②将黑麦属划分为4个种，即一年生异花授粉类型
，一年生自花授粉类型和，以及多年生异花授粉类型。

和
又可划分出不少亚种和变型。

其
中，ssp.即普通黑麦，是黑麦属中唯一的栽培类型。

黑麦属中除经大量研究证
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第6期尚海英等：应用RAMP标记研究黑麦属遗传多样性
实可以划分为一个独立的种外，其它物种间的分化界限都还不甚清晰[10~15]。

这为黑麦属细胞遗传学及分子生物学等其它方面的研究提供了诸多不便[16]。

Sanchez de la Hoz等[2]研究发现，RAMP比RAPD更能真实地反映大麦品种间的亲缘关系，但黑麦属不同物种间的RAMP标记聚类结果与已知的分类体系差别很大，没有呈现出明显的规律性。

可能的原因有两点：一是黑麦属表型上的差异与RAMP揭示的DNA 分子水平上的差异之间不存在对应关系，即RAMP 标记不能有效反映黑麦属物种间的亲缘关系；二是材料本身的分类地位和地理来源不够明确。

因为黑麦属植物多为开放的异花授粉类型，高度互交可育，易于接受其它物种植物的遗传物质[16]。

另外，黑麦育种者根据需要，综合不同材料的优良特性，对黑麦物种进行改造和创新，也可能导致其遗传背景变得更加复杂[17]。

因此，黑麦属基因资源的保存、分类及遗传多样性研究亟待进一步开展。

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571。