DNS法测定还原糖的含量

图1为不同条件下溶液的波长——吸光度图（水调零）。
由图1可以看出白色与绿色曲线几乎重合，说明0.0001mol/l葡萄 糖溶液与DNS反应生成的氨基化合物极少，用比色法很难区分， 故此法所能够测量的葡萄糖浓度应大于0.0001mol/l。
由DNS＋H2O曲线可以看出当波长大于530nm时，DNS的吸光度已经很小， 这时DNS对反应生成的氨基化合物吸光度的影响可以忽略。
1 y = -0.14971 + 0.035786x R= 0.9954 0.8
absorbency
0.6
0.4
0.2
glucose standard curve 1
0 0 5 10 15 20 25 30
glucose standard curve1
glucose chroma/10 mol/l
-4
0 0 10 20 30 40 50 60 70 80
g l u c o s e s t a n d a r d c u rv e 2
g l u c o s e c h r o m a /1 0 m o l / l
-4
当所测得的吸光度比较小时，可用图1中的方程 ，当所测得的吸光度较大时，可用图2中的方程
3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 440
DNS+H O
2
DNS+10 mol/l glucose
DNS+10 mol/l glucose amide
-4
-3
A
460
480
500
520
540
560
580
Fig.1
wavelengh/nm
图2为4号试管稀释10倍后波长扫描图
4号试管用高浓度的葡萄糖溶液和少量的DNS试剂反应，使 生成大量的氨基化合物，但其吸光度太大，仪器无法测定，故 将其稀释10倍。以水调零未出现最高峰，以DNS调零时（图2） 在540nm处有最高峰，这说明在该浓度下，DNS可能会对氨基 化合物吸光度的测量有较大影响，故测量时以DNS调零较准确 。选择540nm作为最佳吸收波长。
0.3 0.29 0.28
A
0.27 0.26 0.25 0 10 20 30 40 50 60
Time Time/min
picture 4
4 反应溶液的酸度范围的选择 取试管按下表加相应试剂，由于所用器皿为试管，不方便用PH 计调节PH，此次实验采用加入不同量的6%的盐酸溶液的办法， 以PH试纸调节溶液的酸度。煮沸20min后，各加入7ml水定容 为10ml，流水冷却，以DNS试剂调零，在540nm处测吸光度。
试管 号 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 DNS/ ml 0 2 2 2 2 2 2 2 2 2
水 /ml
3
1
11*1 04mol /l糖 /ml
0
1
1
1
1
1
0
1
1
1
煮沸 时间 /min
15
5
10
15
20
25
15
30
40
50
由图4可以看出，随着煮沸时间的加长，吸光度 加大，另有实验表明单纯加热DNS试剂也会使其 吸光度增大，故在制作标准曲线和测定未知浓 度时，煮沸时间必须相同。此次实验确定最佳 煮沸时间为30min。
试管号 0 1 2 3 4 5 6 7
DNS/ml
0
2
1
1.5
2
2.5
3
3.5
水/ml
3
1
11* 104mol/l 葡萄糖
0
0
1
1
1
1
1
1
由图3可以看出溶液的吸光度随着DNS用量的增大而 增大，但当DNS用量达到3.5ml时，吸光度反而下降， 这说明DNS的用量不是越多越好，只要在与糖的反应中 DNS有剩余即可。如果DNS用量过多，会使测量时DNS溶 液浓度过大，造成测量不准。综合考虑，此次实验选 定的DNS用量为2ml管按下表加相应溶液，沸水 浴15min, 均加入7ml水定容为10ml，流水冷却，在不 同波长处分别进行扫描。 试管号 0 DNS/ml 0 水/ml 糖/ml 3 0 1 2 1 0 2 2 1 3 2 1 4 1 2
（10 -3mol/l）（10-4mol/l） （10-2mol/l)
下一步实验计划：
1.重复以上已做实验，找到几组较准确的实 验数据，做出葡萄糖标准曲线。 2.探索秸秆中葡萄糖含量与产氢量的关系， 将本次实验结果服务于生物制氢。
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dns法测定还原糖的含量35二硝基水杨酸溶液与还原糖溶液共热后被还原成棕红色的氨基化合物在一定范实验围内反应的还原糖的量和棕红色物质颜色深浅的程度成一定比例关系可测定生成化合物的吸光度由标准曲线反推出还原糖的浓度
DNS法测定还原糖的含量
@@
实 验 原 理
3，5-二硝基水杨酸溶液与还原 糖溶液共热后被还原成棕红色 的氨基化合物，在一定范实验 围内反应的还原糖的量和棕红 色物 色 的 成一定 ， 定 成化合物 的 ， 反 还原糖的 ， ， ， 物 还原糖 量的 定
试管号 0 1 2 3 4 5 6 7
DNS/ml
0
2
2
2
2
2
2
2
水/ml
3
1
11*10-4mol/l葡萄 糖
0
0
1
1
1
1
1
1
PH
/
〉14
11
8
9
10
7
〉14
图5中的PH是用PH试纸调出的，该曲线只能反映变化趋势。 由图5可以看出，溶液的碱性越强，反应进行的越完全， 溶液的酸度越小，越有利于氨基化合物的生成。另外由于 DNS试剂就是用NaOH溶液配制的，单纯DNS与水的混合 液的PH值已经超过14。且DNS在反应中是过量的，反应时 间是足够长的，故测量时只需将被测溶液调至中性，无需 刻意调节反应混合物溶液的PH值，保证测量时DNS试剂、 糖的用量与制作标准曲线时相同即可。
显色条件包括: 波长选择，显色剂用量， 显色时间，溶液酸度，显 色温度，有机络合物的稳 定性及共存离子的干扰等 。此次实验选择波长选择 ，显色剂用量，显色时间 ，溶液酸度进行实验。
一．试剂的配置 DNS试剂：称量18.1992g酒石酸钾钠溶于50ml蒸馏水 中， 加热， 趁热加入0.6313g 3，5-二硝基水杨酸 （DNS），另配制2mol/lNaOH溶液，取26.2ml加入上 述溶液中，称量0.5128g苯酚和0.5064g无水亚硫酸钠 移入配置好的溶液中，蒸馏水定容至100ml，该试剂 避光保存7～10天。 葡萄糖标准溶液（1.0*10-2mol/l）：准确称量0.1990g 无水葡萄糖，待溶解后定容至100ml容量瓶中。 葡萄糖标准溶液（1.0*10-3mol/l）：取10ml上述102mol/l溶液，稀释至100ml容量瓶中。 葡萄糖标准溶液（1.0*10-4mol/l）：取10ml上述103mol/l溶液，稀释至100ml容量瓶中。
0.3 0.25 0.2
A
0.15 0.1 0.05 0 6 8 10
PH
picture 5
12
14
16
PH
三． 标准曲线的建立
取试管按下表加相应试剂，由0.01mol/l葡萄糖标准液配 制x*10-4mol/l（3<=x<=27）的葡萄糖，煮沸30min后，各 加入7ml水定容为10ml，流水冷却，以DNS试剂调零，在 540nm处测吸光度。
另外采用较高浓度的葡萄糖来制作标准曲线，得到下图2： 其回归方程为：y=-0.10483+0.031804x,R=0.99817.
2 .5 y = - 0 .1 0 4 8 3 + 0 . 0 3 1 8 0 4 x 2 R = 0 .9 9 8 1 7
absorbency
1 .5
1
0 .5
g l u c o s e s t a n d a r d c u rv e
0.3 0.28 0.26
A
0.24 0.22 0.2 0.18 0.16 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 dosage of DNS
picture 3
dosage of DNS/ml
4
3.反应时间(水浴时间) 取试管按下表加相应溶液， 沸水浴相应时间后,加入7ml水定容为10ml，流水冷却， 以6号试管中的DNS试剂调零，在540nm处测吸光度。
0.2
吸 光 度 A
0.18 0.16 0.14 0.12 0.1 0.08 510
λ/nm
wavelengh
520 530 540 550 560 570
Fig.2
4号试管稀释10倍后波长扫描
2.DNS用量选择 取试管按下表加相应溶液，沸水浴 30min, 加入适量水使定容为10ml，流水冷却，以1号 试管中DNS溶液为参比，在540nm处测吸光度。
试管号 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
DNS/ml
0
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
水/ml
3
1
葡萄糖/ml
0
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
浓度/104mol/l
3
5
7
9
11
13
15
17
19
21
23
25
27
下图1为葡萄糖标准曲线图，葡萄糖含量（mol/l） 与相应的吸光度（A）有一定的线性关系，且其回归方程为： y = - 0.14971+0.035786x， R= 0.9954。