肺癌患者血浆中.

《癌症》Chinese Journal of Cancer，2009，28（4）：384－389
·基础研究·
1．南京医科大学第一附属医院
医学检验科，
江苏南京210029
2．江苏省实验诊断学重点实验室，
江苏南京210029
3．江苏省分子诊断与生物治疗
高技术平台，
江苏南京210029
4．南京医科大学第一附属医院肿瘤科，江苏南京210029
1．Department of Laboratory Medicine，The First Affiliated Hospital of
Nanjing Medical University，
Nanjing，Jiangsu，210029，P．R．China 2．The Key Laboratory for Laboratory Medicine of Jiangsu Province，Nanjing，Jiangsu，210029，P．R．China 3．The Platform for Molecular Diagnosis and Biotherapy of Graveness Disease
of Jiangsu Province，
Nanjing，Jiangsu，210029，P．R．China 4．Department of Oncology，
The First Affiliated Hospital of
Nanjing Medical University，
Nanjing，Jiangsu，210029，P．R．China
通讯作者：潘世扬
Correspondence to：Shi-Yang Pan Tel．：86．25．83674121
Email：sypan＠njmu．edu．cn
基金项目：江苏省卫生厅重大项目
科研基金（No．H200707）；
江苏省科技厅社会发展基金（No．BS2007073，No．BM2006113）；
江苏省实验诊断学重点实验室基金（No．XK200731）
Grants：Project of Health Administration of Jiangsu Province（No．H200707）；Project of Jiangsu Science and Technology Department
（No．BS2007073，No．BM2006113）；Project of Key Laboratory of Laboratory Diagnosis of Jiangsu Province （No．XK200731）
收稿日期：2008-08-07
修回日期：2008-11-03［Abstract］Background and Objective：The protein encoded by adenomatous polyposis coli（APC）gene participates in the signaling transduction pathway．Substantial studies have revealed that hypermethylation of APC gene promoter is closely related to the pathogenesis and development of cancer．This study was to develop a real-time quantitative methylation specific PCR （real-time QMSP）method，and detect the methylation of APC gene promoter in plasma of lung cancer patients．Methods：Genomic DNA with methylated APC gene promoter was extracted from the lung cancer cell line NCI-H460 using phenol-chloroform and quantified by spectrophotometric measurements．DNA was added into200μL plasma samples of healthy volunteers to make 10-fold serial dilutions．Circulating DNA from simulated plasma samples，78 lung cancer patients，31patients with benign lung diseases and23 health controls was extracted using magnetic beads and modified by bisulfite．The concentration of cell-free methylated APC gene promoter in the plasma samples was quantified by the external reference method with the standard curve constructed using simulated plasma．Results：The linear range of the real-time QMSP assay was1．5×102－1．5×105copies／mL and its lowest detectability was1．5×102copies per milliliter plasma．Of78lung cancer patients，positive methylation of the APC gene promoter was detected in tumor tissues of40cases．Among the40lung cancer patients，positive methylation of the APC gene promoter was found in the plasma of19patients （47．5％）．The concentrations of methylated APC promoter in the19lung cancer patients ranged from1．67×102to6．78×103copies／mL，with a median concentration of1．67×103copies／mL．No positive methylation of the APC gene promoter was detected in the plasma of38lung cancer patients without APC gene methylation in tissues，31benign lung diseases and23healthy controls．Conclusions：The newly developed real-time QMSP method allows the quantitative measurement of APC gene promoter methylation in plasma．Hypermethylation of the APC gene promoter in plasma is a potential diagnostic marker for lung cancer diagnosis．
Key words：real-time quantitative MSP，lung neoplasms，plasma DNA，APC gene，DNA methylation
【摘要】背景与目的：APC基因编码的蛋白参与信号转导途径，大量研究证实APC启动子区的高甲基化在肿瘤的发生发展中起重要作用。

本研究建立血浆APC 基因实时荧光定量甲基化特异性基因扩增（methylation-specific PCR，MSP）检测方法，并对临床肺癌患者血浆进行检测，以确定该方法在肺癌诊断中的应用价值。

肺癌患者血浆中APC基因启动子甲基化
定量检测研究
潘世扬1，2，3，谢而付1，2，束永前3，4，高丽1，2，张丽霞1，2，
陈丹1，2，陈进步1，2，赵文君1，2，穆原1，2，张寄南3
Methylation quantification of adenomatous polyposis coli（APC）
gene promoter in plasma of lung cancer patients
Shi-Yang Pan，1，2，4Er-Fu Xie，1，2Yong-Qian Shu，3，4Li Gao，1，2Li-Xia Zhang，1，2Dan Chen，1，2 Jin-Bu Chen，1，2Wen-Jun Zhao，1，2Yuan Mu1，2and Ji-Nan Zhang4
384
近年来，抑癌基因启动子甲基化与肿瘤的发生发展关系受到广泛关注。

APC基因是近年来发现的一种重要抑癌基因，其编码的蛋白是多功能抑制肿瘤的蛋白家族［1］。

大量的研究证实，APC启动子区的高甲基化以致表达缺失，在肿瘤的发生发展中起着重要的作用［2］。

既往对肿瘤组织进行甲基化的检测多半属于回顾性的分析研究，主要用于对某一肿瘤的甲基化状态及其与肿瘤的相关性研究。

事实上，在临床实践中难以取得早期肿瘤患者的肿瘤组织标本，即使通过穿刺等手段可以得到，也不可能多次获得。

目前对早期诊断肿瘤的实验方法的探索多针对血液中存在的一些肿瘤特异性分子标志物。

血浆中DNA含量增高，增高的部分主要来源于肿瘤细胞的死亡［3］。

肿瘤患者血浆中的抑癌基因甲基化的检测，已成为近年来研究的一个热点［4］。

然而，目前使用普通MSP方法对血浆DNA抑癌基因甲基化进行检测，不仅检测结果不能定量，同时由于MSP的检测敏感度低，其检测的阳性率也偏低。

本研究将单克隆化的肺癌细胞株NCI-H460（APC基因甲基化阳性）DNA定量投入到健康人血浆中，建立一种新的基于Taq Man探针的血浆APC 基因甲基化实时荧光定量MSP的检测技术，并确定其检测线性范围。

同时，以已知浓度的模拟血浆样品作为标准品，采用外标准曲线法对肺癌患者血浆中APC基因启动子甲基化进行定量检测。

1材料与方法
1．1标本来源
人胎儿脐带血（cord blood，CB）标本收自江苏省人民医院河西分院正常分娩的健康产妇。

78例肺癌患者为2006年2月至2007年8月在南京医科大学第一附属医院行肺癌手术切除的患者，其中男性51例，女性27例，年龄范围35～71岁，中位年龄53岁。

31例肺部良性疾病患者来自同期呼吸科门诊患者，其中男性18例，女性13例，年龄范围28～69岁，中位年龄48岁。

23例健康对照者为同期在江苏省人民医院门诊作健康体检者，其中男性14例，女性9例，年龄26～70岁，中位年龄49岁。

收集肺癌患者、肺部良性疾病患者和健康者外周静脉血，其中肺癌患者术前采血，血标本采用EDTA-K2抗凝，经3000r／min离心10min分离血浆，再次以12000r／min离心10min获得无血细胞成分的血浆，用1．5mL离心管以每管200μL 分装。

肺癌组织标本收集后立即放入－70℃冰箱。

大细胞肺癌细胞株NCI-H460购自中国科学院上海细胞所，按常规方法37℃复苏，RPMI-1640培养液培养，胰蛋白酶消化传代，用有限稀释法获取单个集落形成的细胞，消化收集。

1．2试剂与仪器
RPMI-1640为Invitrogen公司产品，胰蛋白酶为上海怡成生物科技有限公司产品，新生小牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品，SDS和蛋白酶K为Promega公司产品，酚和氯仿为Sigma公司产品，IPTG、X2Gal、DNA凝胶回收试剂盒、载体pMD182T、感受态细菌DH5α和DNA热启动聚合酶为TaKaRa公司产品，转甲基试剂盒为NEB公司产品，化学修饰试剂盒为Chemicon公司产品，血浆DNA磁珠法提取试剂盒为上海浩源生物科技有限公司产品。

APC甲基化分析的MSP引物序列参见文献［5］，针对APC启动子区的一对通用引物分别为：上游引物5′-ATTGTTATTAATTTTTTTGTTTGTT GGG-3′、下游引物5′-CGAACTACACCAATACAAC CACATATC-3′，预期产物长度为261bp，包括20个CpG位点；针对APC启动子区707位点甲基化检测的引物探针序列分别为：上游引物APCMS707
方法：将APC基因启动子甲基化阳性肺癌细胞株NCI-H460
细胞用有限稀释法获取单个集落形成的细胞，以经典的酚－
氯仿法提取细胞DNA，并用MSP对APC基因甲基化进行验
证，紫外分光光度计定量并以10倍稀释的浓度梯度依次投
入到200μL健康人血浆中，得到模拟肺癌患者血浆，利用
磁珠核酸提取方法从模拟肺癌及肺癌患者、肺部良性疾病
患者和健康对照者血浆中提取DNA，对血浆DNA模板进行
亚硫酸氢盐化学修饰；以模拟血浆样品作为标准品，采用外
标准曲线法对各种血浆样品中APC甲基化进行定量分析。

结果：所建立的实时荧光定量MSP检测方法的线性范围为
1．5×102～1．5×105拷贝／mL，用该方法检测甲基化肿瘤细胞的
DNA其最低检测限为1．5×102拷贝／mL。

78例肺癌患者有
40例组织中检测出APC基因甲基化阳性，其中的19例
（47．5％）肺癌患者血浆中APC基因启动子甲基化阳性，APC
甲基化浓度为1．67×102～6．78×103拷贝／mL，中位浓度为
1．60×103拷贝／mL。

38例组织阴性的肺癌患者、31例肺部良
性疾病患者和23例健康者的血浆APC基因启动子甲基化
均为阴性。

结论：实时荧光定量MSP检测血浆APC基因甲
基化在肺癌诊断方面具有潜在应用价值。

关键词：实时荧光定量MSP；肺肿瘤；血浆DNA；APC基因；
DNA甲基化
中图分类号：R737．9文献标识码：A
文章编号：1000－467X（2009）04－0384－06
潘世扬，等．肺癌患者血浆中APC基因启动子甲基化定量检测研究385
5′-GGGTCGCGAGGGTATATTTTC-3′、下游引物APCMA7075′-CCGACCCGCACTCCG-3′、探针APCMP7075′-JOE-CCCGCCCAACCGCACAACCT-ECLIPSE-3′，目的产物长度为97bp（包含在261bp 中）。

以上引物探针均由Invitrogen公司合成，PCR扩
增仪PTC-100为MJ公司产品，凝胶成像系统为Kodak公司产品，ABI7500荧光定量基因扩增仪为美国ABI公司产品，CO
2
培养箱为ThermoForma产品。

1．3肺癌组织甲基化检测和质控品的制备及鉴定肺癌组织甲基化检测采用MSP方法，具体方法参见文献［5］。

提取人胎儿脐带血淋巴细胞DNA，按下面的体系和步骤进行转甲基：10×NEB Buffer2μL、1．6mmol／L S－腺苷硫氨酸2μL、SssⅠ甲基化酶4U和CB DNA1．3μg，总体系20μL；37℃水浴1．5h，65℃灭活15min。

经亚硫酸氢盐化学修饰的产物即为阳性质控CB＋，未转甲基的CB DNA经化学修饰后即为阴性质控CB－，以普通MSP方法进行鉴定，具体步骤参见文献［6］。

1．4NCI-H460细胞株的APC基因启动子区克隆测序
用1．2节所述方法合成的通用引物对化学修饰后的NCI-H460的DNA进行扩增，然后进行电泳、切胶、纯化，克隆到质粒中测序，具体步骤参见文献［7］。

1．5模拟肺癌患者血浆的制备
采用经典的酚-氯仿法提取NCI-H460细胞DNA，紫外分光光度计定量，分别投入200μL健康人血浆中，使血浆中DNA量分别为0．2μg、0．02μg、0．002μg、0．0002μg、0．00002μg（分别相当于每200μL血浆中含3×104、3×103、3×102、3×10、3个拷贝肿瘤细胞基因组DNA）。

1．6血浆DNA的提取
取上述肺癌患者、肺部良性疾病患者、健康对照者以及不同浓度模拟肺癌患者的血浆，用血浆DNA磁珠法试剂盒提取血浆中的DNA，具体步骤参见文献［8］。

1．7NCI-H460细胞APC基因甲基化定量标准曲线及未知患者检测
将以上提取的血浆DNA采用S7820化学修饰试剂盒进行化学修饰，采用实时荧光定量MSP
检测，体系成分如下：H
2
O11．9μL、5×Buffer5μL、dNTPs（10mmol／l）1．0μL、MgCl2（250mmol／L）0．4μL、APCMS707（5mmol／L）1．0μL、APCMA707（5mmol／L）1．0μL、APCMP707（5mmol／L）0．5μL、TaKaRa Ex Taq HS0．2μL、样本模板投入量为4μL；扩增条件：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃40s，50个循环。

以模拟肺癌患者血浆作为标准品血浆，设定基线和阈值后，以投入不同浓度的标准品肿瘤DNA的模拟血浆的C t值与初始浓度的对数值作标准曲线，得到标准曲线方程式为C t＝－斜
率lgC
＋截距，定量计算公式C
APC
＝10
Ct－截距
斜率
（）。

1．8统计学方法
采用STATA6．0软件进行统计学处理。

两组样本间中位数比较采用Mann-Whitney检验，多组样本间中位数比较采用Kruskal-Wallis检验，率的比较采用Fisher’s确切概率法进行分析，P＜0．05为有统计学意义。

2结果
2．1肺癌组织APC基因甲基化检测结果
在78例肺癌患者中，有40例患者癌组织中检测到APC基因启动子区存在甲基化改变，另外38例未检测出APC基因启动子区甲基化改变。

2．2CB＋及NCI-H460单个克隆细胞株APC基因甲基化的MSP鉴定
CB＋和由NCI-H460细胞株单个克隆化所得到的4A11细胞经甲基化引物扩增，出现90bp产物（见图1），表明NCI-H460APC启动子区存在甲基化。

2．3APC基因启动子区克隆测序
使用通用引物将化学修饰的DNA模板扩增后测序，结果20个CpG位点中的胞嘧啶（C）仍为C （见图2），同时，非CpG位点中的C则变成为T。

2．4APC基因实时荧光定量MSP方法的建立分别投入0．2μg、0．02μg、0．002μg和0．0002
图1APC基因甲基化引物扩增产物的电泳图Figure1Detection of APC gene in the NCI-H460lung cancer cell line by methylation specific polymerase chain reactions
（MSP）
Lane M：marker；Lane1：cord blood（＋）；Lane2：cord blood（－）；Lane3：NCI-H460；Lane4：H2O．
潘世扬，等．肺癌患者血浆中APC 基因启动子甲基化定量检测研究386
μg NCI-H460细胞DNA的模拟肺癌患者血浆均有DNA扩增，而投入0．00002μg NCI-H460细胞DNA、空白血浆和H2O的模拟肺癌患者血浆均没有扩增，实时荧光定量MSP可以检测到200μL血浆中投入0．0002μg肿瘤基因组DNA，根据1拷贝人细胞基因组DNA等于3．3pg，相当于1mL血浆中能检测出150拷贝肿瘤细胞的DNA（图3）。

一次实验中不同浓度的标准品肿瘤DNA的模拟血浆的C t值分别为34．8、37．2、39．5、41．7，C t值与初始浓度的对数值作标准曲线，得到标准曲线方程式为C t＝－2．29lgC0＋33．27，其中斜率为－2．29，截距为33．27，R2＝0．9996（见图4）。

2．5临床血浆样本的检测
用实时荧光定量MSP检测血浆APC基因启动子甲基化，40例肺癌患者组织为阳性的患者中有19例血浆中检测出阳性（部分检测结果见图3），阳性率达47．5％（19／40），而38例肺癌患者组织为阴性的患者、31例肺部良性疾病和23例健康者的血浆中均没有检测到APC基因启动子甲基化阳性，其特异性为100％。

40例在组织中检测出APC甲基化的肺癌患者按不同资料分组后，各组血浆中甲基化检出率见表1，不同年龄组（P＝1．000）
图2NCI-H460细胞中APC基因经化学修饰后的甲基化测序结果
Figure2Detection of the APC gene in the NCI-H460lung cancer cell line by bisulfite sequencing
The arrow indicates to the CpG sites．
图3实时荧光定量MSP扩增曲线
Figure3The amplification plot of real-time quantitative methylation-specific PCR
1：positive control；2：0．2μg standard plasma；3：0．02μg standard plasma；4：0．002μg standard plasma；5：0．0002μg standard plasma；6：0．00002μg standard plasma；7：lung cancer patient1；8：lung cancer patient2；9：blank plasma；10：H2O．
潘世扬，等．肺癌患者血浆中APC 基因启动子甲基化定量检测研究387
和不同性别组（P＝0．511）的甲基化检出率差异无统计学意义，而不同病理组织类型组的差异有统计学意义（P＝0．035），未分化癌组、腺癌组和未明确分型组明显高于鳞癌组。

19例血浆APC基因启动子甲基化阳性的肺癌患者其血浆甲基化APC 浓度范围为1．67×102～6．78×103拷贝／mL，中位浓度为1．60×103拷贝／mL。

19例肺癌患者按照不同资料进行分组后，各组中位浓度见表2，不同年龄（P＝0．741）、性别（P＝0．189）和病理组织类型分组（P＝0．515）的患者中甲基化APC中位浓度的差异无统计学意义。

3讨论
已有大量研究证实肿瘤患者血浆中肿瘤特异性循环DNA显著升高［9］，并且这一改变可发生在肿瘤早期。

因此，检测血浆中这些抑癌基因甲基化可用于肿瘤的早期诊断。

目前检测DNA甲基化的技术中，最常用的是基于亚硫酸氢盐修饰的MSP 技术，其结果通过扩增后采用电泳进行判断。

MSP 检测过程中对标本DNA进行提取和化学修饰，会有大量DNA模板丢失和降解［8，10］，因此MSP仅对含大量DNA的肿瘤组织标本适用，而难以用于检测血浆DNA中微量水平的抑癌基因甲基化。

Fischer 等［11］曾采用两步法MSP对肺癌血清标本进行检测，其第一次扩增产物需再进行二次扩增才有可能通过电泳检测到阳性条带，这大大增加了实验操作的繁琐程度，同时还会出现相互的交叉污染，导致假阳性，所以临床上难以推广应用。

因此，建立高敏感性的DNA甲基化检测技术就显得尤为重要。

本研究组既往研究结果显示，普通MSP和荧光定量MSP（SYBR Green I染料）对血浆中APC基因甲基化的最低检测限分别为1．5×104拷贝／mL和1．5×103拷贝／mL［12］。

为了提高检测敏感性，本次研究将提取的单克隆化后的NCI-H460细胞DNA进行定量，以10倍梯度稀释后投入到健康人血浆中，得到5个不同浓度的APC基因甲基化阳性标准品；对标准品和待测肺癌患者血浆样本同步提取、
图4实时荧光定量MSP的标准曲线
Figure4The standard curve of real-time quantitative
methylation-specific PCR
1：0．2μg standard plasma；2：0．02μg standard plasma；3：0．002μg standard plasma；4：0．0002μg standard plasma．
表140例癌组织甲基化APC阳性的肺癌患者血浆中
甲基化APC的检出率
Table1APC promoter methylation in plasma of40lung cancer patients with positive APC methylation in tumor
tissues
Item
Age（years）
＜60
≥60
Gender
Female
Male
Histology
Squamous cell carcinoma Adenocarcinoma Undifferentiated
Small cell carcinoma Unknown Cases
16
24
13
27
9
12
9
2
8
Detectivity of APC
methylation in plasma
［％（cases）］
50．0（8／16）
45．8（11／24）
38．5（5／13）
51．9（14／27）
33．3（3／9）
50．0（6／12）
66．7（6／9）
0（0／2）
50．0（4／8）
P value
1．000
0．511
0．035
表219例肺癌患者血浆中甲基化APC的浓度与临床
资料的关系
Table2Association of plasma APC promoter
methylation with clinicopathologic parameters in19lung
cancer patients
Item
Age（years）
＜60
≥60
Gender
Female
Male
Histology
Squamous cell carcinoma
Adenocarcinoma
Undifferentiated
Unknown
Cases
8
11
5
14
3
6
6
4
The median concentration
of plasma APC promoter
methylation（copies／mL）
1．13×103
2．07×103
5．29×103
1．03×103
5．98×102
1．13×103
2．42×103
5．29×103
P value
0．741
0．189
0．515潘世扬，等．肺癌患者血浆中APC 基因启动子甲基化定量检测研究
388
化学修饰和基因扩增后，绘制标准曲线，可以对待测标本进行准确定量。

研究证实本技术的检测线性范围为1．5×102～1．5×105拷贝／mL，其最低限可达1．5×102拷贝／mL，比杨晓菲等［13］报道的SYBR GreenⅠFQ-PCR检测下限的7．8×104拷贝／mL具有更高的敏感性。

当血浆浓度高于1．5×105拷贝／mL也可能在线性范围内，但对于实际检测可能没有意义，因为肺癌患者外周血浆难以达到这个浓度。

当低于1．5×102拷贝／mL，如15拷贝／mL的这个浓度，由于提取过程的丢失和化学修饰的降解，随机吸取APC甲基化阳性的模板可能达不到1个拷贝，从而导致实时荧光定量MSP为阴性。

使用本研究建立的方法，在肿瘤组织为阳性的肺癌患者的血浆中，APC基因启动子甲基化检出率为47．5％（19／40）；而在健康对照组的血浆中，没有检测出一例阳性，这也证实了肿瘤患者血浆DNA 主要来源于肿瘤细胞死亡释放的结论［4］。

肺癌患者血浆的甲基化检出率在不同年龄和不同性别组患者之间差异没有统计学意义，而在不同病理组织类型分组中差异有统计学意义，未分化癌组、未明确分型组和腺癌组明显高于鳞癌组，可能与肺癌类型中的恶性程度及是否容易产生转移有关。

在检出的19例肺癌患者血浆中甲基化APC基因中位浓度在不同年龄、性别和病理组织类型分组中差异无统计学意义。

根据推算，本法可检测出肿块直径小于1cm（1×109个肿瘤细胞）患者的外周血甲基化改变［12］，而CT检查只能发现1cm以上的肿块，传统的X线检查更是只能发现2cm以上的肿块。

如此，本研究所建立的检测方法在肺癌早期诊断方面可能具有重要的应用价值。

本研究建立了一种新的基于Taq Man探针的血浆APC基因甲基化实时荧光定量MSP的检测技术，其检测线性范围宽，敏感性高，可以用于血浆中微量APC基因启动子甲基化的定量检测。

对临床样本检测的结果提示该技术有助于肺癌的早期诊断。

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［编辑及校对：甘可建］［1］
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潘世扬，等．肺癌患者血浆中APC基因启动子甲基化定量检测研究389。