建立紫花苜蓿PHYA和PHYB mRNA表达水平FQ-PCR检测方法

江西农业学报2011,23(4):96~100Acta Agr i culturae Jiangxi
建立紫花苜蓿
PH Y A 和PH Y B mRNA 表达水平
FQ -PCR 检测方法
樊文娜,严学兵,王成章
*
收稿日期基金项目国家自然科学基金项目光敏色素B 调控苜蓿秋眠的分子机理研究(35)。

作者简介樊文娜(),女,河南许昌人,助研,主要从事牧草营养研究。

*通讯作者王成章。

(河南农业大学牧医工程学院,河南郑州450002)
摘要:紫花苜蓿的秋眠与光敏色素基因的表达紧密相关。

为了建立一种快速、灵敏检测紫花苜蓿PH Y A 和PHY B 基因
mRNA 表达水平的实时逆转录聚合酶链反应(FQ -PCR )体系,本研究提取紫花苜蓿叶片总RN A ,PCR 扩增Actin 、PH Y A 和PH Y B 基因片段,将其克隆入p MD18-T 载体进行测序。

基于SYBR Green I 双链嵌合染料建立检测紫花苜蓿PHY A 和PH Y B 基因mRNA 表达水平方法,对PCR 产物的熔解曲线进行分析评价其特异性,经测序鉴定目的片段已插入p MD18-T 载体内,重组质粒的构建非常成功。

为验证其准确性,我们检测紫花苜蓿WL-232PHY A 、PHY B mRNA 表达量,结果证明:所建立的测定PH Y A 和PH Y B 基因mRNA 水平的方法准确,适用于紫花苜蓿的各种组织的大量样本检测。

关键词:S YB R G reen I ;紫花苜蓿;PHY A ;PHY B;mRNA 表达量;秋眠
中图分类号:S963.223.3文献标识码:A 文章编号:1001-8581(2011)04-0096-05
E stabli sh m ent of FQ -PCR M et hod for M easure m ent of E xp ression
ofPH Y A and PH Y B mRNA i n A l fa l fa
FAN W en-na ,YA N Xue-b i ng ,WAN G Cheng-zhang *
(College ofAn i m a l Sc i ence and Vete ri naryM edicine ,H enan Agricu lt ural Uni ve rsity ,Zhengz ho u 450002,Ch i na)Abstra ct :The fa ll dormancy of a lfa lfa i s close l y re l ated w it h t he ex pressio n leve l s of phytochro me genes .In order to establi sh a rapid and sens i tive rea l-ti m e rev e rse transcripti on-pol y m erase cha i n reacti on (FQ-PCR )syste m for detecti ng the expressi on leve ls ofPH Y A and PHY B mRNA i n a lfalfa ,t otal RNA was extracted fro m alfa lfa leaves ,and the partial sequences of Acti n ,PHY A and PH Y B genes were clo ned byRT-PCR.Subsequently ,the m ethod ofmeasuri ng the expressi on l eve l s ofPHY A andPHY B mRN A i n al falf a was set up by analyzi ng and evaluating t he m elti ng curves and specificity of PCR products with S YB R Green I dye .To ver if y t he accuracy of th i s establi shed FQ -PCR syste m,the expressi on l evels of PHY A and PHY B mRNA i n a lfalfa variety WL -232we re tested ,the results sho wed that thism ethod of testi ngPH Y A andPHY B mRNA l eve lwas accurate ,and co u l d be used for m easur i ng l ots of sa m ples of alfa lfa variety .
K ey wor ds :S YBR Green I ;A lfa lfa ;PH Y A ;PH Y B;mRN A expressi on ;F all dor m ancy
苜蓿是长日照植物,晚春及夏季长日照利于其生长发育,秋冬短日照下休眠,说明苜蓿秋眠存在着光周期效应
[1,2]。

由于光敏色素(Phytoc h r o me ,P HY)是光周期反
应的主要受体[3]
,因此在苜蓿的秋眠性(Fall dor mancy ,
FD)研究中,通过测定不同秋眠型苜蓿P H Y A 、PHY B mR NA 的表达水平,探讨其调控机理,对光敏色素的研究具有重大的理论研究意义和应用价值。

试验研究发现,稳态木本植物光敏色素mRNA 水平受日照影响
[4]
,日照长
度的变化通过PHY A 的表达实现调控植物的开花和休眠3,且PHY B 作为绿色植物主要光受体通过光周期调控或参与了苜蓿的秋眠。

实时荧光PC R 技术是目前最准确、重现性最好和国际公认的核酸分子定量定性检测标准方法,被广泛用于转基因研究、基因表达研究、药物疗效考核和病原体检测等诸多领域。

已出现的荧光定量PC R 方法有多种
[5~7]
,其中应用前景最广泛的方法为S YB R
Green I 荧光染料和Taq Man 探针法[8,9]。

本文基于
S YB R G I 荧光染料利用实时荧光R 技术就建立
检测紫花苜蓿PHY A 和P H Y B mRNA 表达水平的方法进行探讨,为从分子水平研究光敏色素调控苜蓿秋眠机理提供基础。

1材料与方法
1.1
材料
采用实验室盆栽的秋眠型紫花苜蓿品种
WL-232(FD 2)叶片。

研究中使用的主要仪器为:普通P CR 仪(ABI 96well Th er mal Cycler);实时荧光定量PCR (ABI 7700荧光PC R );凝胶成像系统(I nGen i us L HR 230V)。

1.2方法
1.2.1总RNA 提取与检测
总RNA 提取采用试剂盒,
具体操作按照试剂盒说明书进行。

提取的RNA 质量由OD 260/OD 280比值和1.0%普通琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.2
Actin 、P H Y A 、P H Y B 的引物设计
根据本实验室
已克隆出的PHY A 的基因全长和预测的蒺藜状苜蓿Y B 的基因全长
[~]
设计肌动蛋白基因、Y :2011-01-18
:077127:1981
:reen PC PH 1012Actin PH A
和PHY B 的引物。

具体序列如下:引物Acti n :5!-GC C GAC CTCGTC ATACTGGT -3!,5!-TCTTTTGGATT
GGGC TT C GT-3!,预计扩增产物的长度为80bp ;引物A:5!-TGAC AAAC TACC AAACC CC AAAG -3!,5!-AT GAC AGC GATGAA GATGGAGA-3!,预计扩增产物的长度为82bp ;引物B :5!-GC TTGTGC AGCC AGTTTGTTT-3!,5!-CAATC CC AAC ACC ATCTTC ATC -3!,预计扩增产物的长度为146bp 。

1.2.3Actin 、PHY A 、PHY B RT-PCR 反应条件的优化采用下述条件配制反转录反应体系:25m mol /L MgS O 42L ,缓冲液2
Bca 1st Bu f fer 5
L ,无酶水RNase F r ee
d H 2O 0.75L ,核苷酸d NTP(10m mo l/L)0.5L ,酶抑制剂RNas
e I nh i b itor (40U /L )0.25L ,反转录酶
Bca B ES T Poly merase(22U /L)0.5L ,随机引物Ran
do m 9m ers 0.5L ,阳性对照RNA 0.5、10
L 。

上述
PC R 反应在普通PC R 仪(ABI 96well Ther m al cycler)
进行。

Taq 酶S YB R Pre m i x Ex TaqT M (2)10.0
L ,PC R
上游引物For war d Prm i er(10mol/L)0.4
L ,PC R 下游引物Rever se Prm i er(10mol /L)0.4L ,染料ROX R ef
ere n ce Dye(50
)0.4
L ,DNA 模板2.0
L ,无酶水
R Nase F r ee d H 2O 6.8
L ,20
L 反应体系,反应参数为
95#30s 预变性、95#5s 、60#30s 共40个循环。

扩增完毕后,进行熔解曲线分析,94#1m i n ,60#1m i n ,以0.1#/s 的速度升温到92#,连续监测荧光。

实时荧光定量PCR 检测在ABI-7700荧光PCR 仪进行,对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析特异性,电泳后在凝胶成像系统(I nGen i us L HR 230V)拍照。

实验中的总RNA 提取试剂盒、逆转录相关试剂、S YBR Gree n I 荧光染料均使用Ta Ka R a 公司产品(DD9108A 、DRR023A 、DRR041T),p MD18-T 载体、D H5a 感受态菌株均使用Ta Ka Ra 公司产品。

1.2.4目的基因PHY A 和P H Y B 表达量的定量测定测定PHY A 、PHY B mRNA (M essenger RNA ,信使核糖核酸)表达量,选用管家基因Actin 为内参,结果以2-Ct
表
示,其中
Ct 为C t 目的基因-Ct 参比基因
[13]。

2结果
2.1紫花苜蓿目的基因片段的确认、克隆测序结果显
示,扩增产物为特异条带,大小与预期80bp 、82bp 和146
bp 的目的片段相符(如图1)。

图1紫花苜蓿PH Y A 、PH Y B 与Ac tin 基因片段
琼脂糖凝胶电泳图
目的片段经回收后与载体p MD19-T 连接,转化感受态细胞,蓝白菌落进行初步筛选。

随机挑取白色菌落进行菌液培养,将含pG M -T-Acti n 、P HYA 、P HYB 质粒的菌液送宝生物工程(大连)有限公司进行测序分析,其结果与设计引物所用模板序列利用DNAMAN 软件检测完全一致,并且在NCBI 数据库中的Blsast 结果与Me d i c ago trunc a t u l a 的MTY F 9_FA _FB _FC 1G-O -4基因、M e d ic ago s a tiva c ultivar WL -525HQ phytoc h r o me A
(P H Y A)、Me d ic ag o s a ti va c u ltiv ar Vernal phyt oc h r o me B (P H Y B )基因序列几乎一致,说明由引物得到的Ac tin 、PHY A 、PHY B 的RT-PCR 产物与目的基因相符。

测序结果NCBI 序列比对表明,序列已正确插入到质粒载体中(如图2、3、4),PCR
产物为目的片段。

图2Actin
基因序列分析及同源性比较
图3Y 基因序列分析及同源性比较
97
4期樊文娜等:建立紫花苜蓿PH Y A 和PH Y B mRNA 表达水平FQ -PCR 检测方法
PH A
图4PH Y B 基因序列分析及同源性比较
2.2Actin 、PH Y A 与PH Y B 荧光定量PCR 标准曲线和熔解曲线分析
依次按10-1
、10-2
、10-3
、10-4
、10-5
等依
此比例稀释模板标准物,其浓度的对数与相应的Ct 值可以作出一条标准曲线。

不同梯度定量模板的对数值与循环数(Ct 值)之间有着非常好的相关关系(r>0.99,在实际应用中,当r>0.95,斜率-3.0~-3.9的标准曲线均被认为可行)。

Actin 、PHY A 与PHY B 斜率为-3.225、-3.548、-3.339,PCR 效率均大于99%,说明该体系可以用于荧光定量PC R 体系。

由图5可见,PHY A 、PHY B 与Actin 荧光定量PC R 熔解曲线为单一峰,无非特性性荧光的产生,这3对引物均具有很强的特异性,可见曲线峰型正常,可以进行下一步定量实验。

2.3
SYB R G reen FQ -PCR 测定紫花苜蓿P H Y A 、
PH Y B mRNA 表达量
为了验证PHY A 和PHY B
mRNA
图5
PH Y A 、PH Y B 与Acti n 荧光定量PCR 熔解曲线
表达水平的准确性,我们测定了处理30d 后紫花苜蓿2级品种WL-232在8h (short da y ,S D ;样品1、2、3)、12h (m idd le day ,MD ;样品4、5、6)和16h (long day ,L D;样品7、8、9)Acti n 、PHY A 、PHY B 基因的Ct 值,利用计算公式2
-Ct
即可求出PHY A 、PHY B mRNA 表达量。

表1Acti n 、PH Y A 、PH Y B 的C t 值
基因C t1C t 2C t 3Ct4C t5C t 6C t 7C t8C t 9Actin 26.0926.1726.0125.7025.5625.6323.0523.1923.17P H Y A 34.2034.0534.1334.6734.2734.9631.2131.2731.20P H Y B
26.12
26.13
26.11
25.87
25.48
25.68
25.05
25.10
24.90
表2PH Y A 、PH Y B m RNA 表达量
基因123456789P H Y A 0.00360.00360.00360.00200.00240.00220.00350.00340.0035P H Y B
0.9794
0.9760
0.9808
0.9693
0.9669
0.9646
0.2500
0.2661
0.2579
试验证明:在中短日照情况下,PHY B mRNA 含量较高,长日照情况下PHY B mRNA 合成量较小,符合秋眠型苜蓿光敏色素的合成规律,且合成量规律与其蛋白水平的表达基本一致
[14]。

本试验中采样部位为光下苜蓿的
幼嫩叶片,P H Y A 在此条件下规律不明显,而在植物黄化时含量最丰富,黑暗中其合成量是光下的50~100倍[5],在光下迅速降解;Y B 是喜光植物体内含量最丰富的光敏色素
[6]。

由数据可看出,Y B 表达量远远大
于Y 的表达量,因此,建立的紫花苜蓿Y 和Y B RN 相对表达水平的方法是准确的。

3讨论
3.1RT-PCR 方法建立的重要性
检测基因表达水
平的方法有Norther n 印迹、Rnase 保护分析、原位杂交和定量RT -PCR 。

在20世纪90年代中期诞生的实时P CR 技术具有定量准确、检测范围宽、敏感性高、精确度高、无R 后处理步骤、产出率高、可以进行多重检测的优点,使其在基础研究和分子诊断领域得到较多的应用。

在许多诊断和研究应用中序列特异的荧光探针(如T q M )被看作是标准的检测模式
[,]
,但它不适合用于对
98
江西农业学报23卷
1PH 1PH PH A PH A P H m A PC a an 1718
大量不同基因序列进行定量,因为研究中每一种扩增子都需要一种新探针,而合成探针费用较高。

3.2体系建立过程中的优化及应该注意的问题S YB R Green荧光染料所建立的实时PCR法具有无毒、无放射性污染、操作简便、需设计特异性荧光探针及其配套引物、敏感性高、反应条件优化和设计思路简单、成本较低等特点,只要反应条件合适即可实现任何目的基因的实时定量[19]。

但由于S YBR Gree n I荧光染料为双链DNA 特异性染色,它不仅和靶基因的扩增产物结合,也会同非特异性PC R产物结合,从而影响结果判断,故引物设计及PC R条件优化显得尤为重要,要求务必确保PCR扩增产物的条带清晰且单一。

在本试验中特别注意对最适引物的筛选,荧光定量产物长度80~150bp最好,最长不要超过300bp,试验中3个基因引物的扩增片段均在80~150bp之间,凝胶电泳条带清晰且单一,测序结果也很理想;其扩增出来的3个基因的熔解曲线非常标准,没有杂峰和引物二聚体的出现。

进行熔链反应时,随着温度逐渐升高双链解链,荧光信号随之下降。

当温度在T m 值左右时双链数量急剧减少,荧光量也急剧下降,由此可确定T m值。

结果显示特异扩增产物熔解温度均一、峰的形状也比较锐利,空白对照熔解曲线同靶基因产物的明显不同。

Actin、PHY A、PHY B T m值均在80#左右,曲线峰型正常。

由于实时PC R扩增片段较短,容易产生引物二聚体,因此对引物的特异性要求较高。

本试验引物的特异性非常强,最终没有引物二聚体的出现。

假如实验中出现引物二聚体,可以在反应结束时减去空白信号以去除二聚体等实物的影响,也可直接通过控制循环次数以使反应在出现明显的二聚体信号前结束,或者调整退火温度来去除等等。

3.3在紫花苜蓿秋眠性研究中的应用价值近些年来,随着分子生物学的日益兴起和发展,人们也开始从基因分子水平来阐明光敏色素的作用机制。

Butler等1959年发现[20],植物感受和测量日照长短是通过叶片中的光敏色素完成的,双子叶植物中至少存在5种不同的光敏色素基因,即PHY A、PHY B、PHY C、PHY D和PHY E,而P H Y D、P H Y E和P H Y C与PHY B在功能上有重叠[21,22],许多实验都证明,光敏色素对基因表达的调控大都在转录水平上进行的[23~24],从光敏色素的活化到基因表达之间存在着一系列的信号传导中间体[25]。

Ni[26]等发现的蛋白因子P I F3(转录调节因子),与PHY B的P f r直接结合,控制基因的表达。

研究拟南芥中光敏色素家族基因功能的结果表明:PHY A、P H Y B是在室内正常生长条件下表现最突出的两种光敏色素基因[27],且PHY B作为绿色植物主要光受体可能通过光周期调控或参与了苜蓿的秋眠[]。

研究发现,日照长度的变化通过Y的表达实现其调控植物的开花和休眠[33~35],且光反应通过光敏色素来改变温度反应[,3,33,35],温度反应通过FT基因直接影响PHY B调控开花时间[34],光和温度均调控植物的开花和秋眠[36~38],因此,研究不同环境条件下(光照、温度等)光敏色素基因mRNA的表达水平可能是揭示紫花苜蓿秋眠性的分子机理的关键内容之一。

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3结论与讨论
通过对小麦相对产量与土壤有效磷、速效钾测试值进行方程拟合,以小麦相对产量大于95%、85%、75%、65%、55%和小于55%为标准,得出土壤肥力等级为高、较高、中等的土壤有效磷含量分别为大于22.8、11.7、6.0 mg/kg;对应的土壤速效钾含量分别为大于114.5、63.7、35.4mg/kg。

同时针对不同肥力等级下土壤磷、钾养分含量的值,得到了相应的施肥标准。

这些结果为扬州市邗江区小麦生产全面应用数字化测土配方施肥技术奠定了基础[3~4]。

在建立作物养分丰缺指标体系时,应遵循以下基本原则数值取整,在系统中,尽量采用整数,以方便系统参数的设置;数值取大,系统中输入的丰缺指标,可以比试验数据稍微偏大,可以适当提高丰缺标准,满足作物的生长需要。

因为试验总是比大田更加注重人为管理,有可能导致产量偏高[5];合理估计,有的数值无法通过试验得到,比如速效钾中低和较低的临界值,需要通过专家评估得到;符合实际,丰缺指标的制定要符合实际施肥需要。

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