急性髓系白血病中骨髓微环境介导耐药的探索ppt课件

皮下成瘤实验：与基质 细胞共同皮下注射的 AML细胞形成的肿瘤明 显大于单独皮下注射 AML形成的肿瘤，活化 AML 细 胞 中 miR-494 的 表达后可抑制皮下肿瘤 的形成
体内实验：活化AML细胞中miR-494表达后与基质细胞共同尾静脉注入 NOD/SCID小鼠，建立白血病小鼠模型。 miR-494高表达组的小鼠生存 期高于对照组，外周血及骨髓中白血病细胞增殖速度低于对照。
套细胞淋巴瘤(MCL)，滤泡淋巴瘤(FCL)，弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者的原代 淋巴瘤细胞与MSC细胞系HK共培养后，HDAC6蛋白的表达均上调
通过逆转录病毒载体感染Jeko-1 使之高表达miR-548m（左上）， 通过realtime PCR（左下）和 western（右）检测HDAC6的表达， 结果发现HDAC6的表达下降。
AML细胞系U937, KG1a, 及AML原代细胞与MSC共培养后，细胞凋亡率明显下降。 在单独培养的AML细胞中加入米托蒽醌后，U937，KG1a，原代AML细胞的凋亡率 分别为43.5%，48.7%，71.8%。与MSC共培养后加入米托蒽醌， U937，KG1a， 原代AML细胞的凋亡率明显下降。
MSC主要通过凋亡和血管生成两种途径干扰AML细胞的生存，通过10058F4或 干扰的方法使AML细胞中的c-Myc表达下降，通过western blot检测发现抗凋亡 相关蛋白如Bcl2, Bcl-XL表达上调，血管生成蛋白如VEGF表达上调。而促凋亡 蛋白如caspase-3和PARP的剪切体表达下调。
干扰HBL-2中HDAC6后，生存的集落数 低于对照组。 HDAC6 knockout-HBL-2 与HK共培养后，集落数也低于对照。
在单独培养组与共培养组加入 环孢素A和/或米托蒽醌，检测 淋巴瘤细胞的凋亡率。
集落形成实验结果显示，加入环孢素A 后，共培养组的集落数多于单独培养组。
体内成瘤实验结果显示， 将HK和HBL-2共同皮下注射组的 瘤体明显大于单独注射HBL-2组
当环磷酰胺与 氟达拉滨联用时 MSC对CLL细胞 的保护作用消失
Western blot结果显示CLL细胞与MSC共培养后， 促细胞凋亡相关蛋白如Mcl-1和PARP的剪切体表达下降
骨髓基质细胞慢性淋巴细胞白血病 （CLL）细胞耐药中起重要作用。该文
作者将人和小鼠骨髓基质细胞系和人 CLL细胞共培养，检测药物诱导的细胞
Yang Yang, Saradhi Mallampati, Baohua Sun,et al. Wnt pathway contributes to the protection by bone marrow stromal cells of acute lymphoblastic leukemia cells and
通过荧光素酶报告载体实验证实miR-494是c-Myc的负向调控子
通过逆转录病毒载体提高AML细胞中miR-494的表达。 (A)感染后AML细胞中miR-494的表达上调。 (B)感染后AML细胞中c-Myc的表达下调 (C)Western blot检测发现感染后AML细胞中c-Myc蛋白的表达下调
凋亡的改变。研究结果表明骨髓基质细 胞可保护CLL细胞免受氟达拉滨诱导细 胞凋亡。骨髓基质细胞也保护CLL细胞
免受地塞米松和环磷酰胺诱导的细胞凋 亡。骨髓基质细胞可保持Mcl-1，并保 护CLL细胞免受氟达拉滨诱导的Mcl-1 和PARP裂解
2013年JCI一篇文章报道c-Myc/miR-548m/HDAC6通路 在非霍奇金B细胞淋巴瘤的细胞耐药中起重要作用
检测白血病干、祖细胞中Hes1、p21表达
通过芯片比较microRNA表达改变
荧光报告载体实验证实miR-9是Hes1负向调控子
干扰miR-9表达可抑制AML细胞增殖
干扰miR-9表达后检测白血病细胞周期的改变
在异基因小鼠模型中干扰miR-9表达，检测对小鼠生存期的影响
ห้องสมุดไป่ตู้
miR-9通过下调Hes1的表达对AML细胞 的增殖、凋亡起作用。干扰miR-9表达 后可抑制AML细胞扩增。
为阐明MSC上调AML细胞中c-Myc的机制，通过基因芯片比较了与MSC共 培养前后AML的microRNA表达谱。
挑选出6个与c-Myc调控相关的microRNA。通过realtime PCR验证找到miR-494和 miR-17是调控c-Myc的microRNA。通过生存曲线分析，发现miR-494与AML患者 的OS和PFS密切相关，定为下一步研究的靶miRNA。
与MSC共培养后，KG1a，U937 (A)及 AML原代细胞(B)中c-Myc的表达升高。
10058F4是c-Myc的特异性抑制剂，在AML细胞培养中加入10058F4， AML细胞c-Myc的表达明显下降(B)，AML细胞的凋亡率明显升高(A)。
与MSC共培养体系中加入10058-F4，AML细胞的凋亡率高于未加10058F4组。
通过siRNA干扰使AML细胞系U937中c-Myc的表达下调(A)。 干扰后，AML细胞的凋亡增加，加入米托蒽醌后，干扰组的凋亡率高于未干扰组(B)。
通过transwell实验证实，MSC对AML细胞起作用需要两者间紧密接触。如图A所示， AML细胞与MSC共培养后其凋亡率显著下降，而transwell实验显示凋亡率无明显变化。 同样，如图B所示， AML细胞与MSC共培养后c-Myc的表达升高，而transwell实验中 c-Myc表达无明显改变。
反之，干扰Jeko-1细胞miR-548m 的表达（左上）后，HDAC6的表 达增加。
荧光素酶报告载体实验证实miR-548m负向调控HDAC6
HBL-2与HK共培养后，生成的集落数明显多于单独培养组。
HBL-2高表达miR-548m后，生存的集落数 低于对照组。 miR-548m+HBL-2与HK共 培养后，集落数也低于对照。
HBL-2细胞高表达miR-548m后，瘤体较对照缩小。与HK共同 注射后，miR-548m+组的瘤体也小于miR-548m-组
miR-548m的表达与c-Myc呈负相关 干扰c-Myc表达后，miR-548m的表达上调
上调miR-548m表达后，c-Myc的表达下降 加入c-Myc抑制剂后检测HBL-2的凋亡率
Tian C, You MJ, Yu Y, Zhu L, Zheng G, Zhang Y. MicroRNA-9 promotes proliferation of leukemia cells in
谢谢
淋巴瘤细胞系HBL-2, SUDHL-4与另一种MSC细胞系HS-5共培养后， HDAC6的蛋白表达上调（左），miR-548m的表达下调（右）
套细胞淋巴瘤(MCL)，滤泡淋巴瘤(FCL)，弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者的原代 淋巴瘤细胞与MSC细胞系HK共培养后，miR-548m的表达均下降
急性髓系白血病（AML）是一种对化疗不敏感的 恶性血液病。AML细胞和骨髓（BM）微环境之 间的相互作用在AML耐药中起着至关重要的作用。 基质细胞是骨髓微环境中影响AML细胞的组成部 分。我们研究的目的是阐明基质细胞对AML细胞 耐药的作用基质。结果发现，AML细胞系U937， KG1a细胞和原代AML细胞与MSC共培养后，可 减少药物诱导的细胞凋亡。Western结果发现共 培养后AML细胞c-Myc的表达上调。加入c-Myc
急性髓细胞白血病（Acute myeloid leukemia，AML）是 髓系造血干/祖细胞恶性疾病。以骨髓与外周血中原始 和幼稚髓性细胞异常增生为主要特征，临床表现为贫血、 出血、感染和发热、脏器浸润、代谢异常等，多数病例 病情急重，预后凶险，如不及时治疗常可危及生命。
化疗联合造血干细胞移植是AML的主要治疗手段。尽 管患者预后已有极大改善，仍有部分患者复发或难药， 降低了AML患者的OS及PFS。
将B细胞淋巴瘤细胞系与MSC细胞系HK共培养后，通过基因芯片发现miR-548m, miR548f和miR-548h的表达下调(A)。Taqman realtime PCR结果发现B细胞淋巴瘤细胞系 Jeko-1, HBL-2, SUDHL-4与MSC细胞系HK共培养后，miR-548m的表达下调(B)。 Western blot结果同样显示在这三种细胞系与HK共培养后，HDAC6的蛋白表达上调(C)。
我们既往研究发现，骨髓基质细胞通过 c-Myc的依赖的途径保护白血病细胞 免受化疗诱导的凋亡。然而，这一过程
的具体机制仍然是未知的。为了阐明机 制，我们通过microRNA芯片和 TaqMan实时定量PCR分析与基质细胞 共培养前后白血病细胞系的microRNA 表达改变。结果表明，microRNA-494 （miR-494）在共培养的AML细胞表达 MC下eicllr-o调MReNd。Aia-t4e报9d4DA告rcutgiv基Rateios因nistSa分unpcpe析reinssA证ecsutB实eoMnmeyeMloiaRidrr-oL4weu9Sket4rmo是miaalcCmellsy. Pclo的s O负ne.向In s调ubm控iss子ion 。在共培养体系中
总结：
白血病微环境中的多种细胞成分对白血病细胞有保护作用， 其中包括基质细胞（间充质干细胞）。为阐明机制，该文 作者将急性淋巴细胞白血病细胞与骨髓基质细胞共培养， 研究后者对白血病细胞基因和蛋白水平的影响。结果表明 Wnt信号参与MSC介导白血病细胞耐药。阻断Wnt通路可 增强白血病细胞对化疗的敏感率，改善白血病小鼠模型的 存活率。
将感染后的AML细胞与MSC共培养，发现其OD值没有明显改变，说明过表达 miR-494后可拮抗MSC引起的AML增殖改变。加入米托蒽醌后，miR-494+AML 细胞的OD明显下降，说明miR-494过表达可拮抗MSC诱导的耐药
体外实验证实miR-494活化 可抑制化疗药物诱导的AML 细胞凋亡
文献报道急性髓系白血病对化疗不敏感，部分原因是骨 髓中的基质细胞对白血病细胞的保护作用。
2013年cancer letter一篇文章报道了Wnt信号通路在MSC介导的 ALL细胞耐药中的作用机制，阐明此通路可作为靶向治疗靶点。
该文首先报道MSC对ALL细胞增殖和凋亡中的影响。(A)与MSC共培养 的ALL细胞系其凋亡率下降。(B)与MSC共培养的ALL原代细胞其凋亡率下降。
Western blot结果发现与MSC共培养后细胞周期相关蛋白的表达改变。
与MSC共培养后ALL细胞的wnt通路相关基因及蛋白表达改变。
加入wnt抑制剂后，可促进ALL细胞的凋亡
小动物活体成像实验发现加入wnt通路抑制剂及阿糖胞苷后， 小鼠体内瘤体明显缩小，生存期延长。说明wnt通路抑制剂 可拮抗MSC诱导的ALL细胞耐药
淋巴瘤细胞及其微环境处于一个动态的 相互作用中。使用克隆培养和裸鼠移植
瘤生长系统模型，本文表明，套细胞淋 巴瘤（MCL）和其他非霍奇金淋巴瘤 细胞与基质细胞共培养后可产生耐药性，
促进淋巴瘤细胞的克隆形成，并诱导组 蛋白去乙酰化酶6（HDAC6）的表达。 此外，基质还可激发c-myc / miR548m前馈回路，导致c-myc的持续活 化，mir-548m的下调，和HDAC6的上 调，从而导致淋巴瘤细胞的扩增和淋巴 瘤进展。加入HDAC6抑制剂和/或c-
2009年Blood一篇文章报道骨髓基质细胞可保护CLL细胞逃避药物诱导的凋亡， 从而导致CLL细胞的耐药
小鼠MSC与CLL细胞共培养后，可降低氟达拉滨诱导的CLL细胞凋亡
同样，人MSC与CLL细胞共培养后，可降低氟达拉滨诱导的CLL细胞凋亡
MSC与CLL细胞共培养后，可降低地塞米松诱导的CLL细胞凋亡