过瘤胃葡萄糖对围产期奶牛空肠微生物群落和黏膜代谢及免疫相关基

动物营养学报２０１９，３１（７）：３１４３⁃３１５５ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎ
㊀
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００６⁃２６７ｘ．２０１９．０７．０２５
过瘤胃葡萄糖对围产期奶牛空肠微生物群落和
黏膜代谢及免疫相关基因表达的影响
张小丽１，２㊀吴㊀建１，２㊀韩雪峰１㊀谭支良１㊀焦金真１∗
（１．中国科学院亚热带农业生态研究所，亚热带农业生态过程重点实验室，畜禽养殖污染控制与资源化技术
国家工程实验室，湖南省畜禽健康养殖工程技术中心，农业部中南动物营养与饲料科学观测实验站，
长沙４１０１２５；２．中国科学院大学，北京１０００４９）
摘㊀要：本试验旨在探究过瘤胃葡萄糖对围产期奶牛空肠微生物群落和黏膜代谢及免疫相关基因表达的影响㊂选择１０头围产期荷斯坦奶牛［４ ５岁㊁体重（５１５ʃ４２）ｋｇ］随机分为２组，每组５头㊂对照组和过瘤胃葡萄糖组奶牛饲喂相同的基础饲粮，同时对照组每头每日给予９０ｇ过瘤胃脂肪，过瘤胃葡萄糖组每头每日给予２００ｇ过瘤胃葡萄糖㊂预试期１４ｄ（产前第２１天到产前第８天），正试期２１ｄ（产前第７天到产后第１４天）㊂正式期结束后，将所有奶牛（１０头）屠宰并取空肠食糜样品，测定其中挥发性脂肪酸的含量和微生物群落；同时取空肠黏膜样品，进行代谢及免疫相关基因表达分析㊂结果显示：与对照组相比，添加过瘤胃葡萄糖有降低空肠食糜中总挥发性脂肪酸含量的趋势（Ｐ＝０．０９４）㊂与对照组相比，添加过瘤胃葡萄糖有上调空肠黏膜中葡萄糖转运蛋白４（ＧＬＵＴ４）表达量的趋势（Ｐ＝０．０６３），有下调Ｔｏｌｌ样受体４（ＴＬＲ４）（Ｐ＝０．０６３）㊁白细胞介素－１７Ａ（ＩＬ⁃１７Ａ）（Ｐ＝０．０６３）和白细胞介素－２６（ＩＬ⁃２６）（Ｐ＝０．０６３）表达量的趋势，同时显著性地上调了丙酮酸羧化酶（ＰＣ）（Ｐ＝０．０１６）㊁闭合蛋白（ｏｃｃｌｕｄｉｎ）（Ｐ＝０．０１６）和胰岛素生长因子结合蛋白５（ＩＧＦＢＰ５）（Ｐ＝０．０３２）的表达量，显著性地下调了白细胞介素－２２（ＩＬ⁃２２）（Ｐ＝０．０１６）㊁基质金属蛋白酶１（ＭＭＰ１）（Ｐ＝０．０１６）和基质金属蛋白酶９（ＭＭＰ９）（Ｐ＝０．０３２）的表达量㊂此外，与对照组相比，添加过瘤胃葡萄糖显著性地增加了空肠食糜中梭菌属ⅪⅤ子集的数量（Ｐ＝０．０３６）㊂由此可见，围产期奶牛饲粮中添加过瘤胃葡萄糖可以改善葡萄糖在机体的代谢以及提高免疫力，同时促进免疫相关有益菌梭菌属ⅪⅤ子集的定植，从而缓解围产期能量负平衡导致的不良影响㊂
关键词：围产期；奶牛；空肠；基因表达；代谢；免疫；微生物
中图分类号：Ｓ８１６㊀㊀㊀㊀文献标识码：Ａ㊀㊀㊀㊀文章编号：１００６⁃２６７Ｘ（２０１９）０７⁃３１４３⁃１３收稿日期：２０１８－１２－２９
基金项目：国家重点研发计划项目（２０１６ＹＦＤ０５０１２０６）；湖南省科技重大专项项目（２０１７ＮＫ１０２０）
作者简介：张小丽（１９９３ ），女，重庆人，硕士研究生，从事反刍动物营养研究㊂Ｅ⁃ｍａｉｌ：１０１２９７２８２５＠ｑｑ．ｃｏｍ∗通信作者：焦金真，副研究员，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｊｊｚ＠ｉｓａ．ａｃ．ｃｎ
㊀㊀围产期是指产前３周到产后３周的这一段时间［１］，为了机体适应分娩和分泌乳汁，奶牛的内分泌和代谢在这一时期会发生巨大的变化［２］㊂在奶牛养殖中围产期是一个既特殊又关键的时期，它的饲养管理决定了奶牛整个泌乳期的产奶量和健康状况［３］㊂由于干物质采食量的下降以及泌乳早
期对能量需求的激增导致机体处于能量负平衡状态［４－５］㊂此时，奶牛出现血液中葡萄糖和胰岛素含量降低，胰高血糖素含量增加，激素敏感脂酶活性下降，机体动员体脂［６－７］，释放出游离脂肪酸（ＮＥＦＡ）进入循环并且转移至肝脏，导致脂肪肝等疾病发生［３］㊂除此之外，由于分娩应激和氧化应
㊀
动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报３１卷
激，奶牛的免疫力下降，产后发病率极高，其中包
括乳房炎㊁子宫内膜炎㊁产后败血症等，不利于奶
牛产后生产性能和繁殖性能的发挥，严重影响奶
牛养殖的经济效益［８］㊂为了缓解能量负平衡对动物的损害，调控围产期奶牛的营养，研究学者们进
行了一系列的工作，主要方法有调整围产后期饲
粮能量水平㊁增加饲粮脂肪水平㊁使用饲料添加剂
等［９］㊂２００７年，Ｇｕｏ等［１０］将产前饲粮的能量水平提高至产后饲粮的能量水平，但是结果显示不但没有提高产后的生产性能，反而加剧了奶牛的脂质动员，更容易导致奶牛发生酮病㊂随后，Ｊａｎｏｖ⁃ｉｃｋ等［１１］发现降低产前饲粮能量水平可以轻微缓解奶牛围产期各种变化对奶牛生产性能的影响，但是效果不明显㊂近年，有报道称，瘤胃保护烟酸可以抑制脂肪分解，降低牛奶能量输出，改善转型奶牛产后能量平衡［１２］，这与代谢组学得出的补充烟酰胺可以改变不饱和脂肪酸代谢㊁减轻氧化应激［１３］的结果一致㊂另有研究发现，在奶牛饲粮中添加瘤胃不可降解蛋白质［１４］或脂囊化共轭亚油酸［１５］可以提高繁殖性能乙基纤维素包被的过瘤胃蛋氨酸可以提高奶牛的产奶量，减轻炎症和氧化应激㊂但是，目前缓解负能量平衡㊁提高产乳性能的途径还不统一，需要解决的关键是围产期的葡萄糖代谢㊂
㊀㊀葡萄糖对于奶牛合成牛奶是必不可少
的［１６－１７］，其在小肠内摄取和吸收之后转换成能量比微生物发酵生成ＶＦＡ更加有效［１８］㊂研究发现，十二指肠注射葡萄糖的泌乳奶牛与注射等能ＶＦＡ的泌乳奶牛相比，产奶量和乳蛋白含量都得到了提高［１９］㊂因此，了解肠道内葡萄糖的吸收和代谢是维持围产期奶牛健康㊁提高性能和生产力的关键㊂葡萄糖主要是通过钠依赖转运载体 钠－葡萄糖协调转运蛋白１（ＳＧＬＴ１）㊁钠－葡萄糖协调转运蛋白３（ＳＧＬＴ３）和非依赖钠转运载体 葡萄糖转运蛋白２（ＧＬＵＴ２）㊁葡萄糖转运蛋白５（ＧＬＵＴ５）的主动转运进入肠上皮细胞被吸收［２０－２１］㊂肠上皮细胞与机体免疫密切相关，研究表明，围产期肠上皮细胞发生了形态学上的变化，这些变化是免疫相关基因和生长因子相互作用的结果［２２］㊂肠道微生物区系受饲粮的影响，其同时也会影响机体对营养物质的消化吸收㊂研究发现，肠道黏膜先天免疫功能与微生物多样性之间有着密切的联系［２３］㊂但是目前国内针对围产期奶牛补饲葡萄糖对肠道微生物群落及免疫和代谢相关基因表达的研究鲜有报道㊂因此，本试验通过给围产期奶牛补饲过瘤胃葡萄糖，研究其对围产期奶牛空肠发酵参数㊁微生物群落以及黏膜代谢与免疫相关基因表达的影响，以期为过瘤胃葡萄糖在围产期奶牛养殖中的应用提供理论依据㊂
１㊀材料与方法
１．１㊀试验设计
㊀㊀随机选择体重［（５１５ʃ４２）ｋｇ］相近㊁年龄（４ ５岁）相仿的荷斯坦奶牛１０头，随机分成２个组，每组５头㊂对照组和试验组奶牛饲喂相同的饲粮，同时对照组奶牛每头每日给予９０ｇ过瘤胃脂肪（软脂酸），而试验组奶牛每头每日给予２００ｇ过瘤胃葡萄糖（用脂肪包被，９０ｇ软脂酸＋９０ｇ葡萄糖＋２０ｇ水）㊂奶牛产前与产后饲粮组成及营养水平见表１㊂预试期１４ｄ（产前第２１天到产前第８天），正试期２１ｄ（产前第７天到产后第１４天）㊂试验期间奶牛每日喂料２次，自由采食，自由饮水，１０头奶牛在正试期结束后全部屠宰㊂１．２㊀样品采集
㊀㊀奶牛屠宰按照国家标准ＧＢ１２６９４ ２０１６中方法进行，宰前空腹２４ｈ后，颈部放血致死，屠宰后立即无菌操作取出空肠中段食糜，其中２００ｍｇ左右的食糜经液氮速冻后存于－８０ħ，用于肠道微生物ＤＮＡ的提取及后期分析，剩下的部分取约１．５ｇ左右加入１５０μＬ２５％（质量体积分数）的偏磷酸，离心（４ħ㊁１２０００ｒ／ｍｉｎ，１０ｍｉｎ）后取上清液，－２０ħ保存，用于测定挥发性脂肪酸含量㊂将肠道中内容物去除干净后，用生理盐水和磷酸盐缓冲溶液（ＰＢＳ，ｐＨ＝７．４）冲洗几次，然后用无菌的载玻片刮取２份黏膜样品，液氮速冻，存于－８０ħ用于空肠黏膜附着微生物ＤＮＡ的提取和组织ＲＮＡ的提取㊂
１．３㊀空肠食糜中挥发性脂肪酸含量的测定
㊀㊀将解冻后的上清液４ħ㊁１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，然后将上清液转移至上样瓶内，参照Ｗｕ等［２４］的方法通过气相色谱仪测定空肠食糜中挥发性脂肪酸的含量，并计算总挥发性脂肪酸的含量及各组分占总挥发性脂肪酸的比例㊂
１．４㊀空肠黏膜代谢及免疫相关基因表达的测定１．４．１㊀总ＲＮＡ提取和ｃＤＮＡ的合成
㊀㊀采用ＴＲＩｚｏｌ试剂（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司，美国）从空
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７期张小丽等：过瘤胃葡萄糖对围产期奶牛空肠微生物群落和黏膜代谢及免疫相关基因表达的影响肠黏膜中提取总ＲＮＡ，之后用琼脂糖凝胶电泳和
ＮＤ－１０００超微量紫外分光光度计测定所提取的总
ＲＮＡ的质量和浓度㊂随后用ＴａＫａＲａ公司的
Ｐｒｉｍｅ⁃Ｓｃｒｉｐｔ１ｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ，按照操
作手册反转录为ｃＤＮＡ㊂将反转录产物置于
－２０ħ保存备用㊂
表１㊀奶牛产前与产后饲粮组成及
营养水平（干物质基础）
Ｔａｂｌｅ１㊀Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｎｄｎｕｔｒｉｅｎｔｌｅｖｅｌｓｏｆｄｉｅｔｓｆｏｒｄａｉｒｙ
ｃｏｗｓｉｎｐｒｅｐａｒｔｕｍａｎｄｐｏｓｔｐａｒｔｕｍ（ＤＭｂａｓｉｓ）％
项目Ｉｔｅｍｓ
产前
Ｐｒｅｐａｒｔｕｍ
产后
Ｐｏｓｔｐａｒｔｕｍ
原料Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ
玉米青贮Ｃｏｒｎｓｉｌａｇｅ２４．７０３０．２０
燕麦秸Ｏａｔｈａｙ５５．３０１２．８０
苜蓿干草Ａｌｆａｌｆａｈａｙ１７．１０
玉米Ｃｏｒｎ５．９０７．００
麦麸Ｗｈｅａｔｂｒａｎ９．１０２１．３０
豆粕Ｓｏｙｂｅａｎｍｅａｌ（４９％ＣＰ）４．１０８．０７
碳酸钙ＣａＣＯ３０．２３１．１３
磷酸氢钙ＣａＨＰＯ４０．２３０．４５
食盐ＮａＣｌ０．１６０．４５
碳酸氢钠ＮａＨＣＯ３０．６８
氧化镁ＭｇＯ０．０５０．０９
氯化钾ＫＣｌ０．３２
预混料Ｐｒｅｍｉｘ１）０．２３０．４１
合计Ｔｏｔａｌ１００．００１００．００
营养水平Ｎｕｔｒｉｅｎｔｌｅｖｅｌｓ２）
粗蛋白质ＣＰ１１．６１４．６
粗脂肪ＥＥ２．０２．１
淀粉Ｓｔａｒｃｈ１０．３１４．８
中性洗涤纤维ＮＤＦ５３．６４５．２
酸性洗涤纤维ＡＤＦ３１．３２５．５
粗灰分Ａｓｈ６．８６．０
钙Ｃａ０．５００．９８
磷Ｐ０．４１０．５４
产奶净能ＮＥＬ／（ＭＪ／ｋｇ）５．４４５．７３
㊀㊀１）预混料为每千克产前饲粮提供Ｆｏｒｐｒｅｐａｒｔｕｍｄｉｅｔ，ｐｒｅｍｉｘｐｒｏｖｉｄｅｄｔｈｅｆｏｌｌｏｗｉｎｇｐｅｒｋｇｏｆｔｈｅｄｉｅｔ：Ｃｕ９００ｍｇ，Ｚｎ１３５０ｍｇ，Ｍｎ１０００ｍｇ，Ｃｏ１３ｍｇ，Ｉ２７ｍｇ，Ｓｅ２３ｍｇ，ＶＡ４５００００ＩＵ，ＶＤ３１１００００ＩＵ，ＶＥ５４００ＩＵ㊂预混料为每千克产后饲粮提供Ｆｏｒｐｏｓｔｐａｒｔｕｍｄｉｅｔ，ｐｒｅｍｉｘｐｒｏｖｉｄｅｄｔｈｅｆｏｌｌｏｗｉｎｇｐｅｒｋｇｏｆｔｈｅｄｉｅｔ：Ｃｕ３０４０ｍｇ，Ｆｅ３１７０ｍｇ，Ｚｎ１４２８０ｍｇ，Ｍｎ３０６０ｍｇ，Ｃｏ４０ｍｇ，Ｉ１８０ｍｇ，Ｓｅ１００ｍｇ，ＶＡ２５００００ＩＵ，ＶＤ３３２７００００ＩＵ，ＶＥ５０００ＩＵ㊂
㊀㊀２）营养水平为实测值㊂Ｎｕｔｒｉｅｎｔｌｅｖｅｌｓｗｅｒｅｃａｌｃｕｌａｔｅｄｖａｌｕｅｓ．１．４．２㊀基因表达量的定量
㊀㊀荧光定量ＰＣＲ在Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ４８０Ⅱ序列检测系统（Ｒｏｃｈｅ公司，瑞士）中进行，按照ＴａＫａＲａ定量试剂盒说明书推荐的体系和条件进行反应㊂反应体系为：ＳＹＢＲＧｒｅｅｎⅠ荧光染料预混试剂５μＬ，ＲＯＸ０．２μＬ，上㊁下游引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）各０．２μＬ，ｃＤＮＡ模板１μＬ，灭菌双蒸去离子水３．４μＬ㊂反应程序为：９５ħ预变性３０ｓ；９５ħ变性５ｓ，６０ħ退火和延伸３０ｓ并采集荧光信号，共４０个循环；按仪器操作说明选择熔解曲线分析，６０ħ升至９５ħ１５ｓ，６０ħ１５ｓ㊁９５ħ１５ｓ，自动采集荧光㊂同时，每对引物均设置相应的无模板阴性对照（ＮＴＣ）和无聚合酶污染对照（ＮＡＣ）㊂以β－肌动蛋白（β⁃ａｃｔｉｎ）和３－磷酸甘油醛脱氢酶（ＧＡＰ⁃ＤＨ）为参比基因，按照２－ΔΔＣｔ法计算目的基因的表达量，结果以差异变化（ＦＣ）表示［２５］㊂用于黏膜基因表达的引物序列信息见表２㊂
１．５㊀空肠微生物的定量分析
１．５．１㊀微生物ＤＮＡ的提取
㊀㊀空肠食糜微生物ＤＮＡ的提取采用ＱＩＡａｍｐＤＮＡＳｔｏｏｌＭｉｎｉＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ公司，德国）㊂为了尽可能获得革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的总ＤＮＡ同时又不影响ＤＮＡ结构的完整性，将试剂盒说明书方法进行改进，将破壁温度从７０ħ上调至８５ħ进行ＤＮＡ的提取㊂提取的ＤＮＡ用１．５％凝胶电泳检测其完整性，并用ＮＤ－１０００微量紫外分光光度计测定核酸浓度（ｎｇ／μＬ）及纯度（ＯＤ２６０ｎｍ／ＯＤ２８０ｎｍ）后，于－２０ħ保存备用㊂
１．５．２㊀总细菌及功能微生物的绝对定量
㊀㊀本课题组构建了总细菌及功能微生物的质粒，对总细菌㊁纤维降解菌［产琥珀酸丝状杆菌（Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）㊁黄色瘤胃球菌（Ｒｕｍｉ⁃ｎｏｃｏｃｃｕｓｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ）㊁白色瘤胃球菌（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃ⁃ｃｕｓａｌｂｕｓ）㊁溶纤维丁酸弧菌（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏｆｉｂｒｉｓｏｌ⁃ｖｅｎｓ）］㊁淀粉降解菌［反刍兽新月形单胞菌（Ｓｅｌｅ⁃ｎｏｍｏｎａｓｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）］㊁分解葡萄糖的细菌［普雷沃氏菌属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）㊁栖瘤胃普雷沃氏菌（Ｐｒｅｖｏ⁃ｔｅｌｌａｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ）］及免疫相关细菌［梭菌属ⅪⅤ子集（ＣｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｃｌｕｓｔｅｒⅪⅤ）㊁乳杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌ⁃ｌｕｓ）㊁拟杆菌属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）］进行绝对定量㊂按照焦金真等［２６］的方法，运用已验证的相应的微生物的特异性引物（表３），分别将含有特定微生物组１６ＳｒＲＮＡ基因插入物的质粒ＤＮＡ连续稀释
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动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报３１卷
１０倍，构建标准曲线㊂标准曲线的斜率在－０．３１９７ －０．２９５９，并且相关系数（Ｒ２）均大于０．９９，符合实时荧光定量ＰＣＲ（ｑＲＴ⁃ＰＣＲ）的标准曲线要求㊂根据ＭＩＱＥ指南中微生物引物的扩增效率＝１０－ｓｌｏｐｅ－１（ｓｌｏｐｅ为标准曲线的斜率）［２７］，可以得到本试验中引物的扩增效率均处于９５％ １０５％，说明引物的扩增效率较好㊂同时，每对引物均设置相应的ＮＴＣ和ＮＲＣ㊂然后按照拷贝数公式［拷贝数＝（标准曲线Ｃｔ值得到的拷贝数ˑ每个样品基因组ＤＮＡ的浓度ˑ提取ＤＮＡ时最后溶解ＤＮＡ的ｄｄＨ２Ｏ的体积）／（用于ｑＲＴ⁃ＰＣＲ的ＤＮＡ量ˑ提取ＤＮＡ时所称量的食糜的重量）］计算出每克食糜中总细菌及功能微生物的拷贝数，之后转换为每克食糜中总细菌或功能微生物拷贝数的对数值［ｌｇ（拷贝数／ｇ）］进行统计分析㊂
表２　用于基因定量的引物序列信息
Ｔａｂｌｅ２㊀Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｕｓｅｄｉｎｇｅｎｅｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
基因名称Ｇｅｎｅｎａｍｅｓ
引物序列
Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ
（５ᶄ ３ᶄ）
产物大小
Ｐｒｏｄｕｃｔｓｉｚｅ／ｂｐ
扩增效率
Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ／％
Ｔｏｌｌ样受体２ＴＬＲ２
Ｆ：ＣＴＧＴＧＴＧＣＧＴＣＴＴＣＣＴＣＡＧＡ
Ｒ：ＴＣＡＧＧＧＡＧＣＡＧＡＧＴＡＡＣＣＡＧＡ２２８９８．２
Ｔｏｌｌ样受体４ＴＬＲ４Ｆ：ＧＧＴＴＴＣＣＡＣＡＡＡＡＧＣＣＧＴＡＡ
Ｒ：ＡＧＧＡＣＧＡＴＧＡＡＧＡＴＧＡＴＧＣＣ１３７１０２．８
干扰素－γＩＦＮ⁃γＦ：ＴＧＡＴＧＡＡＴＧＡＣＣＴＧＴＣＡＣＣＡＡＡＡ
Ｒ：ＡＧＧＣＡＧＧＡＧＧＡＣＣＡＴＴＡＣＧＴＴ１００１０５．１
白细胞介素－６ＩＬ⁃６Ｆ：ＴＧＡＣＴＴＣＴＧＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＣＣ
Ｒ：ＧＣＣＡＧＴＧＴＣＴＣＣＴＴＧＣＴＧＴＴ１９３１０５．５
白细胞介素－１７ＡＩＬ⁃１７ＡＦ：ＡＡＣＡＴＣＧＴＴＡＡＣＣＧＧＡＧＣＡＣ
Ｒ：ＧＧＴＧＧＡＧＣＧＣＴＴＧＴＧＡＴＡＡＴ６０９６．２
白细胞介素－１７ＦＩＬ⁃１７ＦＦ：ＣＴＴＧＣＡＧＡＡＣＣＧＣＴＣＣＡＴＣ
Ｒ：ＴＣＣＴＧＴＣＴＴＣＣＴＧＴＣＣＣＴＣＣ１３１１０３．５
白细胞介素－２６ＩＬ⁃２６
Ｆ：ＣＣＧＣＴＧＴＡＴＴＴＣＣＴＧＴＧＣＴＴＣ
Ｒ：ＧＧＣＴＴＴＧＴＡＧＡＴＴＣＣＴＴＴＣＴＴＴＣＣ１００１００．３
白细胞介素－１０ＩＬ⁃１０Ｆ：ＴＧＣＴＧＧＡＴＧＡＣＴＴＴＡＡＧＧＧＴＴＡＣＣ
Ｒ：ＴＣＡＴＴＴＣＣＧＡＣＡＡＧＧＣＴＴＧＧ５１１０３．０
白细胞介素－２２ＩＬ⁃２２
Ｆ：ＡＣＴＧＴＡＧＧＣＴＣＡＡＣＧＡＧＴＣＣＧ
Ｒ：ＣＡＴＣＴＧＴＧＡＴＧＴＴＡＴＣＴＧＣＣＡＡＡＣ９９１０４．４
白细胞介素－４ＩＬ⁃４Ｆ：ＧＣＧＴＡＴＣＴＡＣＡＧＧＡＧＣＣＡＣＡ
Ｒ：ＴＴＧＣＣＡＡＧＣＴＧＴＴＧＡＧＡＴＴＣ７４９８．８
闭合蛋白ＯｃｃｌｕｄｉｎＦ：ＡＣＧＣＡＧＧＡＡＧＴＧＣＣＴＴＴＧＧＴＡＧＣ
Ｒ：ＧＣＡＧＣＣＡＴＧＧＣＣＡＧＣＡＧＧＡＡ１２４１０４．２
封闭蛋白１Ｃｌａｕｄｉｎ１Ｆ：ＧＣＧＣＴＧＣＣＣＣＡＧＴＧＧＡＡＡＧＴ
Ｒ：ＧＧＡＴＣＴＧＣＣＣＧＧＴＧＣＴＣＴＧＣ１１２１００．１
封闭蛋白４Ｃｌａｕｄｉｎ４Ｆ：ＣＣＣＧＣＧＣＣＣＴＣＡＴＣＧＴＣＡＴＣ
Ｒ：ＧＴＴＧＧＣＣＧＡＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧ１８５９８．５
紧密连接蛋白１ＴＪＰ１
Ｆ：ＧＣＡＣＡＴＡＧＧＡＴＣＣＣＴＧＡＡＣＣＡ
Ｒ：ＴＧＣＴＴＣＣＧＧＴＡＧＴＡＣＴＣＣＴＣＡＴＣ１０７９５．８
类胰岛素生长因子受体１ＩＧＦ⁃１Ｒ
Ｆ：ＧＡＴＣＣＣＧＴＧＴＴＣＴＴＣＴＡＣＧＴＴＣ
Ｒ：ＡＡＧＣＣＴＣＣＣＡＣＴＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡ１０１１００．２
类胰岛素生长因子受体２ＩＧＦ⁃２ＲＦ：ＴＡＣＡＡＣＴＴＣＣＧＧＴＧＧＴＡＣＡＣＣＡ
Ｒ：ＧＧＡＴＴＴＣＧＣＴＡＧＣＣＴＧＧＡＧＡＧ１１１９５．５
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７期张小丽等：过瘤胃葡萄糖对围产期奶牛空肠微生物群落和黏膜代谢及免疫相关基因表达的影响续表２
基因名称Ｇｅｎｅｎａｍｅｓ
引物序列
Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ
（５ᶄ ３ᶄ）
产物大小
Ｐｒｏｄｕｃｔｓｉｚｅ／ｂｐ
扩增效率
Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ／％
类胰岛素样生长因子结合蛋白３ＩＧＦＢＰ３Ｆ：ＧＣＧＡＣＡＡＧＡＡＧＧＧＣＴＴＴＴＡＣＡＡ
Ｒ：ＴＡＴＣＣＡＣＡＣＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣ８１１０３．３
类胰岛素样生长因子结合蛋白５ＩＧＦＢＰ５Ｆ：ＣＴＡＣＡＡＧＡＧＡＡＡＧＣＡＧＴＧＣＡＡＡＣＣ
Ｒ：ＴＣＣＡＣＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧＡＴＧ６３１０５．１
胰岛素受体ＩＮＳＲ
Ｆ：ＣＧＧＡＧＣＴＣＡＧＡＧＡＴＣＡＣＧＡＣＴＡＴ
Ｒ：ＡＧＧＴＴＣＡＣＡＧＴＴＡＡＧＴＧＣＴＣＡＧＡＴＧＡ１０６９７．５
生长激素受体ＧＨＲＦ：ＡＣＴＴＧＧＧＣＴＡＧＣＡＧＴＧＡＣＡＴＴＡ
Ｒ：ＴＴＣＣＴＴＴＡＡＴＣＴＴＴＧＧＡＡＣＴＧＧ１０１１０３．７
过氧化物酶体增殖因子激活受体ＰＰＡＲＡ
Ｆ：ＣＧＧＴＧＴＣＣＡＣＧＣＡＴＧＴＧＡ
Ｒ：ＴＣＡＧＣＣＧＡＡＴＣＧＴＴＣＴＣＣＴＡＡＡ５６９９．５
叉头转录因子１ＦＯＸＯ１Ｆ：ＧＣＴＣＣＴＧＧＴＧＧＡＴＧＣＴＣＡＡＴ
Ｒ：ＧＧＣＣＴＣＧＧＣＴＣＴＴＡＧＣＡＡＡＴ１０５９７．３
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白ｍＴＯＲＦ：ＣＣＣＣＧＡＴＣＧＴＧＡＡＧＴＴＡＴＴＴＧ
Ｒ：ＧＴＧＴＧＣＧＴＡＣＡＡＴＣＧＧＡＴＧＡＡ１４１１００．２
核糖体蛋白Ｓ６激酶Ｂ１ＲＰＳ６ＫＢ１Ｆ：ＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＴＡＡＴＴＴＧＴＣＣ
Ｒ：ＴＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＴＣＡＴＧＴＣＧＡＡＧＡ１０１１００．７
葡萄糖转运蛋白１ＧＬＵＴ１
Ｆ：ＣＧＧＣＴＧＣＣＣＴＧＧＡＴＧＴＣ
Ｒ：ＧＣＣＴＧＧＧＣＣＣＡＣＴＴＣＡＡＡ７５１０３．１
葡萄糖转运蛋白４ＧＬＵＴ４Ｆ：ＧＴＣＡＡＣＡＣＡＧＴＣＴＴＣＡＣＣＴＴＡＧＴＣＴ
Ｒ：ＣＣＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＧＡＴＧＧＡ７９９９．９
钠－葡萄糖协同转运蛋白１ＳＧＬＴ１Ｆ：ＣＣＴＧＡＣＴＧＧＧＴＴＴＧＣＴＴＴＣＣ
Ｒ：ＴＧＣＣＴＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＧＴＴＴＣ１０９１０５．４
钠－葡萄糖协同转运蛋白３ＳＧＬＴ３Ｆ：ＡＧＧＡＡＧＧＣＴＴＡＣＧＡＣＴＴＧＴＴＣＴＧ
Ｒ：ＴＧＡＴＧＧＣＧＴＴＧＡＴＧＴＴＣＡＣＴＡＣ１４２１０２．０
单羧酸转运蛋白１ＭＣＴ１Ｆ：ＣＧＡＧＣＣＧＣＧＴＡＴＡＡＣＧＡＴＡＣＴＴ
Ｒ：ＧＡＧＡＡＧＣＣＧＡＴＧＧＡＡＡＴＧＡＡＡＧ１５７１０５．１
丙酮酸羧化酶ＰＣＦ：ＡＣＡＣＣＡＡＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＡＡＴＧ
Ｒ：ＣＡＧＣＧＧＧＡＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＧ３５３９７．６
线粒体磷酸烯醇丙酮酸羧激酶ＰＥＰＣＫ⁃Ｍ
Ｆ：ＣＣＡＴＣＧＧＡＣＴＧＧＴＧＣＣＴＡＡ
Ｒ：ＡＧＡＴＣＣＴＧＧＴＴＧＡＣＣＴＧＴＴＣＴＧＴ１５１１０５．１
基质金属蛋白酶１ＭＭＰ１Ｆ：ＧＧＴＣＡＧＧＴＴＴＡＴＡＧＣＴＴＡＴＧＧＡＴＴＣ
Ｒ：ＴＴＧＡＧＡＧＡＡＧＡＣＡＴＣＡＣＧＧＡＧＡ１２０９８．５
基质金属蛋白酶３ＭＭＰ３Ｆ：ＧＡＴＧＡＴＧＡＡＣＡＡＴＧＧＡＣＡＡＡＧＧ
Ｒ：ＣＧＡＧＧＧＴＣＧＴＡＧＡＣＴＧＧＧＴＡ１３４９８．８
基质金属蛋白酶９ＭＭＰ９
Ｆ：ＧＡＧＧＧＴＡＡＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＴＴＣ
Ｒ：ＡＡＧＧＴＣＡＣＧＴＡＧＣＣＣＡＣＡＴＡＧＴ２３６１０３．９
基质金属蛋白酶１３ＭＭＰ１３Ｆ：ＡＣＣＣＴＴＣＣＣＡＴＧＡＣＣＴＴＡＴＣＴＴ
Ｒ：ＴＣＴＴＣＣＣＴＧＡＡＴＣＣＴＣＡＡＡＧＴＧ１６２１００．４
β－肌动蛋白β⁃ａｃｔｉｎＦ：ＣＴＡＧＧＣＡＣＣＡＧＧＧＣＧＴＡＡＴＧ
Ｒ：ＣＣＡＣＡＣＧＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧＴＡＧ１７７１０２．６
３－磷酸甘油醛脱氢酶ＧＡＰＤＨＦ：ＴＧＧＡＡＡＧＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＴ
Ｒ：ＣＣＣＡＣＴＴＧＡＴＧＴＴＧＧＣＡＧ６０９６．２
７４１３
㊀
动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报３１卷
表３㊀用于微生物定量的引物序列信息
Ｔａｂｌｅ３㊀Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｕｓｅｄｉｎｍｉｃｒｏｂｅｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
项目Ｉｔｅｍｓ
引物序列
Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ
（５ᶄ ３ᶄ）
产物大小
Ｐｒｏｄｕｃｔｓｉｚｅ／ｂｐ
扩增效率
Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ／％
总细菌
Ｇｅｎｅｒａｌｂａｃｔｅｒｉａ
Ｆ：ＣＧＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣ
Ｒ：ＣＣＡＴＧＴＡＧＣＡＣＧＴＧＴＧＴＡＧＣＣ１４６１０５．２
梭菌属ⅪⅤ子集
ＣｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｃｌｕｓｔｅｒⅪⅤＦ：ＣＧＧＴＡＣＣＴＧＡＣＴＡＡＧＡＡＧＣ
Ｒ：ＡＧＴＴＴＹＡＴＴＣＴＴＧＣＧＡＡＣＧ４３０１００．８
乳杆菌属ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓＦ：ＣＴＧＡＴＧＴＧＡＡＡＧＣＣＣＴＣＧ
Ｒ：ＧＡＧＣＣＴＣＡＧＣＧＴＣＡＧＴＴＧ１６６１００．１
拟杆菌属ＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓＦ：ＧＡＧＡＧＧＡＡＧＧＴＣＣＣＣＣＡＣ
Ｒ：ＣＧＣＴＡＣＴＴＧＧＣＴＧＧＴＴＣＡＧ１０８９８．９
普雷沃氏菌属ＰｒｅｖｏｔｅｌｌａＦ：ＧＧＴＴＣＴＧＡＧＡＧＧＡＡＧＧＴＣＣＣＣ
Ｒ：ＴＣＣＴＧＣＡＣＧＣＴＡＣＴＴＧＧＣＴＧ１２１９５．５
栖瘤胃普雷沃氏菌ＰｒｅｖｏｔｅｌｌａｒｕｍｉｎｉｃｏｌａＦ：ＧＡＡＡＧＴＣＧＧＡＴＴＡＡＴＧＣＴＣＴＡＴＧＴＴＧ
Ｒ：ＣＡＴＣＣＴＡＴＡＧＣＧＧＴＡＡＡＣＣＴＴＴＧＧ７４１０２．１
反刍兽新月形单胞菌Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ
Ｆ：ＣＡＡＴＡＡＧＣＡＴＴＣＣＧＣＣＴＧＧＧ
Ｒ：ＴＴＣＡＣＴＣＡＡＴＧＴＣＡＡＧＣＣＣＴＧＧ１３８１０４．４
产琥珀酸丝状杆菌
ＦｉｂｒｏｂａｃｔｅｒｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓＦ：ＧＴＴＣＧＧＡＡＴＴＡＣＴＧＧＧＣＧＴＡＡＡ
Ｒ：ＣＧＣＣＴＧＣＣＣＣＴＧＡＡＣＴＡＴＣ１２１１０５．６
黄色瘤胃球菌
ＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓＦ：ＣＧＡＡＣＧＧＡＧＡＴＡＡＴＴＴＧＡＧＴＴＴＡＣＴＴＡＧＧ
Ｒ：ＣＧＧＴＣＴＣＴＧＴＡＴＧＴＴＡＴＧＡＧＧＴＡＴＴＡＣＣ１３２９９．９
白色瘤胃球菌
ＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓａｌｂｕｓＦ：ＣＣＣＴＡＡＡＡＧＣＡＧＴＣＴＴＡＧＴＴＣＧ
Ｒ：ＣＣＴＣＣＴＴＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＡ１７６１０４．０
溶纤维丁酸弧菌
ＢｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓＦ：ＴＡＡＣＡＴＧＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣ
Ｒ：ＣＧＴＴＡＣＴＣＡＣＣＣＧＴＣＣＧＣ１３６１０３．４
１．６㊀数据统计与分析
㊀㊀试验数据采用Ｒ软件的Ｓｔａｔｓ基础包进行统计分析㊂鉴于目的基因表达量和微生物拷贝数的数据不符合正态分布，因此，采用Ｗｉｌｃｏｘ ｓｒａｎｋ⁃ｓｕｍ非参数检验法分析试验组与对照组在发酵参数㊁基因表达量及微生物拷贝数上的差异㊂结果以平均值和均值标准误表示，Ｐ＜０．０５为差异显著，０．０５ɤＰɤ０．１０为差异趋于显著，Ｐ＞０．１０表示差异不显著㊂２㊀结果与分析
２．１㊀空肠发酵参数
㊀㊀由表４可知，与对照组相比，添加过瘤胃葡萄糖尽管在数值上降低了空肠食糜中乙酸和丁酸的比例，但是差异均没有达到显著水平（Ｐ＞０．１０）㊂然而，添加过瘤胃葡萄糖有降低空肠食糜中总挥发性脂肪酸含量的趋势（Ｐ＝０．０９４）㊂
表４㊀过瘤胃葡萄糖对空肠发酵参数的影响
Ｔａｂｌｅ４㊀Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｒｕｍｅｎ⁃ｐｒｏｔｅｃｔｅｄｇｌｕｃｏｓｅｏｎｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｐａｒａｍｅｔｅｒｓｏｆｊｅｊｕｎｕｍ
项目Ｉｔｅｍｓ
对照组
Ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ
试验组
Ｔｒｉａｌｇｒｏｕｐ
均值标准误
ＳＥＭ
Ｐ值
Ｐ⁃ｖａｌｕｅ
总挥发性脂肪酸含量ＴＶＦＡｃｏｎｔｅｎｔ／（ｍｍｏｌ／Ｌ）５．３４２．９８１．１２０．０９４乙酸比例Ａｃｅｔａｔｅｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ／％７９．０５７７．３２２．１３０．５４８丙酸比例Ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ／％１２．９０１６．２６１．２５０．３１０丁酸比例Ｂｕｔｙｒａｔｅｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ／％８．０５６．４３１．４００．６９１乙丙比Ａｃｅｔａｔｅ／ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ６．４８５．０４０．５８０．４２１８４１３
７期张小丽等：过瘤胃葡萄糖对围产期奶牛空肠微生物群落和黏膜代谢及免疫相关基因表达的影响
２．２㊀空肠黏膜中葡萄糖转运相关基因的表达量㊀㊀由表５可知，与对照组相比，添加过瘤胃葡萄糖有上调空肠黏膜中葡萄糖转运蛋白４（ＧＬＵＴ４）表达量的趋势（Ｐ＝０．０６３），同时显著性地上调了糖异生关键酶丙酮酸羧化酶（ＰＣ）的表达量（Ｐ＝０．０１６）；表中其他葡萄糖转运相关基因的表达量在２组间没有显著差异（Ｐ＞０．１０）㊂
表５㊀过瘤胃葡萄糖对空肠黏膜葡萄糖转运相关基因表达量的影响
Ｔａｂｌｅ５㊀Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｒｕｍｅｎ⁃ｐｒｏｔｅｃｔｅｄｇｌｕｃｏｓｅｏｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｇｅｎｅｓｒｅｌａｔｅｄ
ｇｌｕｃｏｓｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｉｎｊｅｊｕｎａｌｍｕｃｏｓａ
项目Ｉｔｅｍｓ
对照组
Ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ
试验组
Ｔｒｉａｌｇｒｏｕｐ
均值标准误
ＳＥＭ
Ｐ值
Ｐ⁃ｖａｌｕｅ
葡萄糖转运蛋白１ＧＬＵＴ１１．０００．９４０．１００．５５６葡萄糖转运蛋白４ＧＬＵＴ４１．００２．４９０．３４０．０６３钠－葡萄糖协同转运蛋白１ＳＧＬＴ１１．０００．９９０．１３０．７３０钠－葡萄糖协同转运蛋白３ＳＧＬＴ３１．００１．２８０．１９１．０００单羧酸转运蛋白１ＭＣＴ１１．０００．９２０．１７０．５５６丙酮酸羧化酶ＰＣ１．００５．３５０．９５０．０１６线粒体磷酸烯醇丙酮酸羧激酶ＰＥＰＣＫ⁃Ｍ１．０００．４１０．２６０．４１３
２．３㊀空肠黏膜中免疫相关基因的表达量
㊀㊀由表６可知，与对照组相比，添加过瘤胃葡萄糖显著下调了空肠黏膜中细胞因子白细胞介素－２２（ＩＬ⁃２２）的表达量（Ｐ＝０．０１６），并且有下调Ｔｏｌｌ样受体４（ＴＬＲ４）（Ｐ＝０．０６３）㊁白细胞介素－１７Ａ（ＩＬ⁃１７Ａ）（Ｐ＝０．０６３）和白细胞介素－２６（ＩＬ⁃２６）（Ｐ＝０．０６３）表达量的趋势，同时显著上调了ｏｃｃｌｕｄｉｎ的表达量（Ｐ＝０．０１６）；表中其他免疫相关基因的表达量不受过瘤胃葡萄糖的显著影响（Ｐ＞０．１０）㊂
表６㊀过瘤胃葡萄糖对空肠黏膜中免疫相关基因表达量的影响
Ｔａｂｌｅ６㊀Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｒｕｍｅｎ⁃ｐｒｏｔｅｃｔｅｄｇｌｕｃｏｓｅｏｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｇｅｎｅｓｒｅｌａｔｅｄｉｍｍｕｎｅｉｎｊｅｊｕｎａｌｍｕｃｏｓａ
项目Ｉｔｅｍｓ
对照组
Ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ
试验组
Ｔｒｉａｌｇｒｏｕｐ
均值标准误
ＳＥＭ
Ｐ值
Ｐ⁃ｖａｌｕｅ
Ｔｏｌｌ样受体２ＴＬＲ２１．００１．３３０．０９０．１１１Ｔｏｌｌ样受体４ＴＬＲ４１．０００．５８０．１００．０６３干扰素－γＩＦＮ⁃γ１．００１．０１０．２８０．７３０白细胞介素６ＩＬ⁃６１．００１．０７０．３３０．７３０白细胞介素－１７ＡＩＬ⁃１７Ａ１．０００．４２０．１７０．０６３白细胞介素１７ＦＩＬ⁃１７Ｆ１．００１．１３０．２５０．９０５白细胞介素－２２ＩＬ⁃２２１．０００．２００．１５０．０１６白细胞介素－２６ＩＬ⁃２６１．０００．４００．２３０．０６３白细胞介素－４ＩＬ⁃４１．００１．２６０．２７１．０００白细胞介素－１０ＩＬ⁃１０１．００１．１２０．２４０．９０５闭合蛋白Ｏｃｃｌｕｄｉｎ１．００２．６００．３１０．０１６封闭蛋白１Ｃｌａｕｄｉｎ１１．０００．７３０．１８０．４１３封闭蛋白４Ｃｌａｕｄｉｎ４１．０００．７００．１００．２８６紧密连接蛋白１ＴＰＪ１１．０００．９７０．１９０．５５６
２．４㊀空肠黏膜中细胞增殖分化相关基因的表达量㊀㊀由表７可知，与对照组相比，添加过瘤胃葡萄糖显著性地上调了空肠黏膜中类胰岛素生长因子结合蛋白５（ＩＧＦＢＰ５）的表达量（Ｐ＝０．０３２），同时显著性地下调了基质金属蛋白酶１（ＭＭＰ１）（Ｐ＝０．０１６）和基质金属蛋白酶９（ＭＭＰ９）（Ｐ＝０．０３２）
９４１３
㊀
动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报３１卷的表达量，对表中其他细胞增殖分化相关基因的表达量无显著影响（Ｐ＞０．１０）㊂
表７㊀过瘤胃葡萄糖对空肠黏膜中细胞增殖分化相关基因表达量的影响
Ｔａｂｌｅ７㊀Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｒｕｍｅｎ⁃ｐｒｏｔｅｃｔｅｄｇｌｕｃｏｓｅｏｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｇｅｎｅｓｒｅｌａｔｅｄ
ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｉｎｊｅｊｕｎａｌｍｕｃｏｓａ
项目Ｉｔｅｍｓ
对照组
Ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ
试验组
Ｔｒｉａｌｇｒｏｕｐ
均值标准误
ＳＥＭ
Ｐ值
Ｐ⁃ｖａｌｕｅ
类胰岛素生长因子受体１ＩＧＦ⁃１Ｒ１．００１．０００．１４０．７３０类胰岛素生长因子受体２ＩＧＦ⁃２Ｒ１．００１．０９０．１５０．５５６类胰岛素生长因子结合蛋白３ＩＧＦＢＰ３１．００１．４９０．３１０．９０５类胰岛素生长因子结合蛋白５ＩＧＦＢＰ５１．００２．１７０．２５０．０３２胰岛素受体ＩＮＳＲ１．００１．５７０．２１０．２６８生长激素受体ＧＨＲ１．００１．０２０．１００．９０５过氧化物酶体增殖因子激活受体ＰＰＡＲＡ１．００１．１５０．１１０．２８６叉头转录因子１ＦＯＸＯ１１．０００．８８０．１３０．７３０哺乳动物雷帕霉素靶蛋白ｍＴＯＲ１．００１．３４０．１３０．４１３核糖体蛋白Ｓ６激酶ＲＰＳ６ＫＢ１１．００１．２００．２６１．０００基质金属蛋白酶１ＭＭＰ１１．０００．３４０．１５０．０１６基质金属蛋白酶３ＭＭＰ３１．０００．９８０．１８０．７３０基质金属蛋白酶９ＭＭＰ９１．０００．３２０．１７０．０３２基质金属蛋白酶１３ＭＭＰ１３１．０００．７５０．２１０．４１３
２．５㊀空肠食糜中总细菌和免疫相关细菌的数量㊀㊀由表８可知，与对照组相比，添加过瘤胃葡萄糖对空肠食糜中总细菌㊁拟杆菌属和乳杆菌属的数量没有显著影响（Ｐ＞０．１０），但显著地提高了梭菌属ⅪⅤ子集的数量（Ｐ＝０．０３６）㊂
表８㊀过瘤胃葡萄糖对空肠食糜中总细菌㊁拟杆菌属㊁梭菌属ⅪⅤ子集和乳杆菌属数量的影响
Ｔａｂｌｅ８㊀Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｒｕｍｅｎ⁃ｐｒｏｔｅｃｔｅｄｇｌｕｃｏｓｅｏｎｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｏｆｇｅｎｅｒａｌｂａｃｔｅｒｉａ，Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ
ｃｌｕｓｔｅｒⅪⅤａｎｄＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｉｎｊｅｊｕｎａｌｃｈｙｍｅｌｇ（拷贝数／ｇ）
项目Ｉｔｅｍｓ
对照组
Ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ
试验组
Ｔｒｉａｌｇｒｏｕｐ
均值标准误
ＳＥＭ
Ｐ值
Ｐ⁃ｖａｌｕｅ
总细菌Ｇｅｎｅｒａｌｂａｃｔｅｒｉａ７．６３７．５５０．１９０．６９１拟杆菌属Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ６．９２６．９６０．２１１．０００梭菌属ⅪⅤ子集ＣｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｃｌｕｓｔｅｒⅪⅤ５．９６６．７００．２００．０３６乳杆菌属Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ３．１９３．３００．１５１．０００
２．６㊀空肠食糜中碳水化合物降解菌的数量
㊀㊀由表９可知，与对照组相比，添加过瘤胃葡萄糖对空肠食糜中碳水化合物降解菌（降解纤维的产琥珀酸丝状杆菌㊁黄色瘤胃球菌㊁白色瘤胃球菌㊁溶纤维丁酸弧菌与主要降解淀粉的反刍兽新月形单胞菌以及分解葡萄糖的普雷沃氏菌属㊁栖瘤胃普雷沃氏菌）的数量没有产生显著影响（Ｐ＞０．１０）㊂３㊀讨㊀论
㊀㊀围产期时奶牛大多处于能量负平衡状态［４－８］㊂本试验结果中发现，在围产期添加过瘤胃葡萄糖可以降低奶牛空肠中总挥发性脂肪酸的含量，由此推测添加的过瘤胃葡萄糖在小肠中被直接吸收为奶牛供能，而减少了通过发酵供能带来的能量损耗，有效地提高了能量利用率［２８－２９］㊂研究发现围产期添加过瘤胃胆碱［３０－３１］和过瘤胃烟酸［３２］可以显著地提高围产期奶牛的平均产奶量㊂另外，
０５１３
７期张小丽等：过瘤胃葡萄糖对围产期奶牛空肠微生物群落和黏膜代谢及免疫相关基因表达的影响
在围产期奶牛饲粮中添加酵母β－葡聚糖也可以提高产奶量及乳蛋白产量［３３］㊂经十二指肠灌输葡萄糖可以提高奶牛的产奶量㊁乳糖含量和乳蛋白产量［１９］㊂与之吻合的是，本课题组前期试验结果显示，添加过瘤胃葡萄糖可以提高围产期奶牛的产奶量（１８．９ｋｇ／ｄｖｓ．１６．９ｋｇ／ｄ；Ｐ＝０．０１）［３４］㊂如前所述，添加过瘤胃葡萄糖避免了瘤胃对葡萄糖的发酵，葡萄糖可到达小肠，直接作为能量供应者替代了其他转换发酵等形式，提高了能量的利用率，缓解了能量负平衡，某种意义上解释了围产期奶牛产奶量提高的原因㊂
表９　过瘤胃葡萄糖对空肠食糜中碳水化合物降解菌数量的影响
Ｔａｂｌｅ９㊀Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｒｕｍｅｎ⁃ｐｒｏｔｅｃｔｅｄｇｌｕｃｏｓｅｏｎｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｏｆｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ⁃ｄｅｇｒａｄｉｎｇ
ｂａｃｔｅｒｉａｉｎｊｅｊｕｎａｌｃｈｙｍｅｌｇ（拷贝数／ｇ）
项目Ｉｔｅｍｓ
对照组
Ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ
试验组
Ｔｒｉａｌｇｒｏｕｐ
均值标准误
ＳＥＭ
Ｐ值
Ｐ⁃ｖａｌｕｅ
普雷沃氏菌属Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ６．７６６．６９０．２１１．０００栖瘤胃普雷沃氏菌Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ５．０５４．９１０．２２０．８４１反刍兽新月形单胞菌Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ５．４１５．３５０．１２０．７５３产琥珀酸丝状杆菌Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅ４．３７４．８２０．２９０．６９１黄色瘤胃球菌Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ４．６２４．５００．１７０．６９１白色瘤胃球菌Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓａｌｂｕｓ４．０８３．９８０．１５０．９１７溶纤维丁酸弧菌Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ６．６７６．４４０．１６０．６９１
㊀㊀葡萄糖的吸收主要依赖于小肠上皮细胞膜上的转运载体蛋白［３５］㊂转运蛋白载体主要分为２类［２０－２１］：钠－葡萄糖协调转运蛋白（ＳＧＬＴｓ）和葡萄糖转运蛋白（ＧＬＵＴｓ）㊂其中ＧＬＵＴｓ是一种可顺其浓度梯度不消耗能量地被动运输葡萄糖，且受饲粮因素的影响［１８］㊂卢艳娟等［３５］发现，将生长后期滩羊（３６ ４０ｋｇ）的饲粮能量及蛋白质水平提高２０％，可以显著提高小肠中ＧＬＵＴ４的表达量㊂与之类似，本研究发现，添加过瘤胃葡萄糖提高了空肠中ＣＬＵＴ４的表达量，增强了空肠对葡萄糖的吸收和利用㊂姜涛［３６］报道反刍动物所需葡萄糖的９０％是由糖异生提供的㊂糖异生途径的关键酶是ＰＣ和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（ＰＥＰＣＫ），ＰＣ的表达量直接影响到肝脏糖异生的能力［３７］㊂本试验结果显示，围产期添加过瘤胃葡萄糖可以提高空肠黏膜中ＰＣ的表达量，这表明在奶牛能量负平衡的情况下，添加过瘤胃葡萄糖可能会增加糖异生作用，以弥补由于干物质摄入不足引起的能量缺乏，从而缓解能量负平衡㊂
㊀㊀Ｔｏｌｌ样受体（ＴＬＲｓ）是一类在天然免疫中有重要作用的跨膜信号传递的先天模式识别受体，通过识别病原相关分子模式来迅速激活天然免疫系统［３８］，进而诱导炎症因子的表达来参与炎症反应［３９］㊂其中，ＴＬＲ４是机体固有免疫和获得性免疫的桥梁㊂余盼等［４０］发现，ＴＬＲ４在患有乳房炎的奶
牛的乳腺组织中的表达量较正常奶牛高，进而引起其下游的细胞因子ｍＲＮＡ表达量显著升高㊂围产期由于存在多种应激，机体发生免疫抑制，多种免疫细胞功能发生改变［２，６－７］，机体的免疫力下降㊂柒启恩等［４１］的研究表明，围产期母猪饲粮中添加
壳寡糖能显著性地提高母体和子代的免疫力，提高子代的存活率㊂本研究结果显示，与对照组相比，添加过瘤胃葡萄糖下调了空肠黏膜中ＴＬＲ４的表达量和促炎性细胞因子ＩＬ⁃１７Ａ㊁ＩＬ⁃２２㊁ＩＬ⁃２６的表达量；与此同时，具有屏障功能的连接蛋白ｏｃ⁃ｃｌｕｄｉｎ的表达量有所上调㊂这意味着添加过瘤胃葡萄糖可以提高肠道的屏障功能，防止细菌等有害物质进入［２３］㊂由此推断，围产期奶牛饲粮中添加过瘤胃葡萄糖有可能通过介导炎症反应相关通路基因的表达，改变肠道屏障功能，增强围产期奶牛空肠的免疫应答能力㊂
㊀㊀胰岛素样生长因子（ＩＧＦｓ）在细胞分化和增殖过程中发挥重要作用［４０］㊂胰岛素生长因子结合蛋白（ＩＧＦＢＰｓ）是参与协助ＩＧＦｓ的结合能力的主要蛋白，其中ＩＧＦＢＰ５是ＩＧＦＢＰｓ家族中最保守的成员，对ＩＧＦｓ信号具有重要的调节作用㊂研究表明，瘤胃上皮中ＩＧＦＢＰ５的表达量与乳头宽度呈显著正相关，通过促进其形态学发育来促进乳头的
１５１３
㊀
动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报３１卷
增长［４２］㊂景小平［４３］研究表明，冬季给藏绵阳添加精料补充料，瘤胃乳头中ＩＧＦＢＰ５的表达量显著升高，从而促进了瘤胃组织形态的发育㊂鉴于ＩＧ⁃ＦＢＰ５表达量的升高预示着细胞分化及增殖能力的提升，其在添加过瘤胃葡萄糖组的升高可以表征肠道组织形态的改善及代谢功能的增强㊂基质金属蛋白酶（ＭＭＰｓ）是由多种基质细胞㊁炎症细胞等产生的高度保守的一类酶，其中，ＭＭＰ９是参与创面的修复和愈合过程中角质形成细胞从基底膜脱离㊁促进细胞沿创面基质爬行㊁纤维蛋白－纤维连接蛋白基质的再塑形的重要调节蛋白［４４］，而ＭＭＰ１在星状细胞中能够促进细胞外基质的降解和纤维化的逆转［４５］㊂Ｗａｔｈｅｓ等［４６］研究表明，ＭＭＰｓ在子宫内膜破裂中起着重要作用㊂另外，李云涛等［４７］报道，ＭＭＰ９的表达量与创面愈合率呈负相关㊂本研究中，添加过瘤胃葡萄糖下调了空肠黏膜中ＭＭＰ１和ＭＭＰ９的表达量可以预示肠道细胞损伤的修复㊂
㊀㊀饲粮是影响胃肠道微生物群的重要因素之一［４８］㊂例如，在幼羊饲粮中添加大黄有利于回肠黏膜梭状芽胞杆菌㊁乳酸菌和假单胞菌的定植［２３］㊂婴幼儿期肠道菌群定植发生在出生之前，大约３个月后就趋于稳定，其肠道微生物对机体成年期新陈代谢以及后代的免疫系统均有影响［４９］㊂梭菌是肠道一大类兼性厌氧微生物，与许多疾病息息相关㊂有益的梭菌属包括酪酸梭菌㊁普拉梭菌等，它们维持肠道厌氧，保护肠黏膜屏障，防治腹泻的发生㊂有害的梭菌属包括艰难梭菌和产气荚膜梭菌等，它们发酵能力强，产酸产气，损伤细胞膜，导致细胞损伤，引起肠道炎症并导致腹泻［５０］㊂有研究证实，梭菌属ⅪⅤ子集属于拉氏螺旋体科，它的丰富度与患炎症性肠炎的概率呈负相关［５１－５２］㊂本研究结果显示，与对照组相比，添加过瘤胃葡萄糖显著提高了空肠食糜中梭菌属ⅪⅤ子集的数量，却未限制影响其他的功能微生物的数量㊂由此推测，围产期奶牛饲粮中添加过瘤胃葡萄糖有可能通过促进免疫相关有益菌梭菌属ⅪⅤ子集的定植，从而抑制肠道的炎症反应，降低患炎症性肠炎的发生率㊂
４㊀结㊀论
㊀㊀围产期奶牛饲粮中添加过瘤胃葡萄糖可以降低空肠食糜中总挥发性脂肪酸的含量，上调与葡萄糖转运㊁糖异生㊁细胞代谢相关基因的表达，促进免疫有益菌梭菌属ⅪⅤ子集的定植，在缓解炎症反应的同时提高黏膜屏障功能㊂过瘤胃葡萄糖可以作为一种有效的饲料添加剂用于缓解奶牛围产期的能量负平衡状态㊂
参考文献：
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