2005年版药典三部部分附录

2005年版药典三部部分附录
录入时间:2006-6-26 9:14:29 来源：其它
2005年版药典三部部分附录
1．无菌检查法（修订）
2．支原体检查法（增修）
3．病毒外源因子检查法（修订）
4．热原质检查法（修订）
5．细菌内毒素检查法（修订）
6．崩解时限检查法（新增）
7．融变时限检查法（新增）
8．最低装量检查法（新增）
9．装量（片重）差异检查法（新增）
10．粒度检查法（新增）
11．抗毒素F（ab）2测定法（修订）
12．絮状单位测定法（新增）
13．A群脑膜炎球菌多糖疫苗多糖分子大小测定法（增修）
14．伤寒Vi多糖分子量大小测定法（新增）
15．乙醇残留量测定法（康卫氏扩散皿法）（新增）
16．蛋白质含量测定（双缩脲法）（新增）
无菌检查法
无菌检查法系指用微生物培养法检查生物制品是否无菌的一种方法。

无菌检查应在洁净度为10000级环境中的局部洁净度100级、单向流空气区域内或无菌隔离系统中进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染。

单向流空气区、工作台面及无菌隔离系统必须进行洁净度验证。

各种生物制品的无菌检查，均应按照本附录的规定进行，有专门规定者除外。

1 仪器
1.1 取样用灭菌注射器，5、10ml(供直接接种法用)。

1.2 全封闭式集菌培养器，滤膜孔径不大于0.45μm，膜直径约50mm （供薄膜过滤法用）。

1.3 普通显微镜（细菌镜检用）。

2 培养基及其制备方法
培养基应适合需氧菌、厌氧菌或真菌的生长，可按以下处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定的干粉培养基。

2.1 需氧菌、厌氧菌培养基1（流体硫乙醇酸盐1，用于培养需氧菌、厌氧菌）
胰酪蛋白胨(或酪素胰酶消化液，以总氮计2000mg) 15g
酵母浸出粉(或酵母透析液200ml) 5g
葡萄糖 5g
氯化钠 2.5g
L-胱氨酸(或半胱氨酸盐酸盐) 0.5g
硫乙醇酸钠(或硫乙醇酸) 0.5g（0.3ml）
琼脂 0.65～0.75g
刃天青 0.01g
水 1000ml
除葡萄糖和刃天青外，取上述成分加入水中，微温溶解后，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.1±0.2。

在供试品接种前，培养基氧化层的颜色（红色）不得超过培养基深度的1/3，否则，须经水浴煮沸加热20分钟，迅速冷却。

只限加热一次，并防止被污染。

2.2 需氧菌、厌氧菌培养基2 (流体硫乙醇酸盐培养基2)
按需氧菌、厌氧菌培养基1处方，删除琼脂，取其余成分，如法配制，即得。

2.3改良马丁培养基（用于培养需氧菌、真菌）
蛋白胨 5g
酵母浸出粉 (或酵母透析液200ml) 2g
葡萄糖 20g
磷酸氢二钾 1g
硫酸镁 (MgSO4 ·7H2O) 0.5g 水 1000 ml
0.1%虎红 2 ml
除葡萄糖外，取上述成分加入水内，微温溶解后，调节pH值约为6.8，煮沸，加葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH值使灭菌后为6.4±0.2。

2.4 营养琼脂培养基
蛋白胨 10g
牛肉浸粉 5g
氯化钠 5g
琼脂 14g
水 1000ml
取上述成分加入水中，微温溶解后，调节pH值为弱碱性，煮沸，滤清，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2。

上述培养基一般分别按10 ml、40 ml、100 ml或200 ml分装于试管或其他容器中，装量为试管或容器高度的2/5，均以115℃灭菌30分钟。

细菌培养基经30-35℃培养3天，改良马丁培养基经20-25℃培养3-5天后，应无菌生长。

合格的培养基使用期限不得超过一周。

3 培养基灵敏度检查
3．1 菌种由国家药品检定机构分发。

3.1.1 需氧菌乙型溶血性链球菌(CMCC 32210株)，短芽孢杆菌(7316株)。

3.1.2 厌氧菌生孢子梭状芽孢杆菌(CMCC 64941株)。

3.1.3 真菌、白色念珠菌（ATCC 10231）
3．2 菌液制备
将乙型溶血性链球菌、生孢子梭状芽孢杆菌、短芽孢杆菌分别接种于被检的培养基，经30～35℃培养一定时间 (乙型溶血性链球菌和生孢子梭状芽孢杆菌培养24～48小时，短芽孢杆菌培养18～20小时)后，将乙型溶血性链球菌和短芽孢杆菌分别刮入0.9%无菌氯化钠溶液内制成均匀菌液；生孢子梭状芽孢杆菌先将菌液吸入灭菌的试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成均匀菌液；白色念珠菌接种在改良马丁培养基上，置20～25℃培养2-3天后，刮入0.9%无菌氯化钠溶液制成均匀菌液。

再将以上菌液稀释至与标准比浊管（由国家药品检定机构分发）相同之浓度，然后用0.1%蛋白胨水作10倍系列稀释，分别制成10-8乙型溶血性链球菌菌液，10-7的短芽孢杆菌菌液、10-7生孢子梭状芽孢杆菌菌液及10-6白色念珠菌菌液。

3.3 培养基接种
将10-7的短芽孢杆菌、10-7生孢子梭状芽孢杆菌、10-8乙型溶血性链球菌和10-6 白色念珠菌菌液各1 ml
分别接种到每管9 ml被检培养基中，(用于厌氧菌的培养基在试管中装量高度不得低于7cm)。

每种菌液至少接种3管，并用未接种的培养基做对照，将接种乙型溶血性链球菌、生孢子梭状芽孢杆菌的培养基置30～35℃培养3天，接种短芽孢杆菌的培养基置30～35℃培养5天，接种白色念珠菌的培养基置20～25℃培养5天，记录结果。

3.4 结果判定
接种后培养基管数有2/3以上呈现生长，则判为该培养基的灵敏度合格。

培养基灵敏度：乙型溶血性链球菌(32210株)应达到10-8，短芽孢杆菌(7316株)和生孢子梭状芽孢杆菌(64941株)应达到10-7，白色念珠菌（ATCC 10231 株）应达到10-6。

3．5 附注
3.5.1 不应在同一洁净室内同时操作两个菌株。

3.5.2 无菌检查用培养基应每批进行灵敏度检查，合格后方可使用。

3.5.3 各生产单位的质量检定部门应定期抽检无菌检查用培养基的灵敏度。

国家药品检定机构应定期抽检各生产单位的无菌检查用培养基。

4 各种培养基的采用
4.1 检查需氧性和厌氧性杂菌，应采用流体硫乙醇酸盐培养基。

检查不含汞类防腐剂制品中的需氧性和厌氧性杂菌时，该培养基中可不加硫乙醇酸盐。

4.2 检查真菌和腐生菌时，应采用真菌培养基。

4.3 检查混浊制品时，可采用不含琼脂的硫乙醇酸盐培养基。

检查活疫苗时，可适当增加琼脂含量，做成斜面。

5 抽样量及抽检瓶数
5.1 原液及半成品
除半成品除菌后需立即分装、留样作无菌检查的制品外，原液及半成品应每瓶（罐）分别进行无菌检查，其抽样量应至少为0.1%，但不得少于10ml。

原液及半成品每开瓶一次，应如上法抽验。

体外用诊断制品半成品每批取样至少3ml。

5.2 成品
每亚批均应进行无菌检查，供试品应随机抽取，应具有代表性(包括分装过程的前、中、后供试品或冻干过程不同层冻干柜中的供试品)。

成品抽验量分出厂制品抽验量和上市制品监督抽验量两种。

5.2.1 出厂制品抽验量
5.2.1.1 分装量在100支(瓶)或以下者抽检不少于5支，101～500支(瓶)者抽检不少于10支(瓶)，501～10000支(瓶)者抽检不少于20支(瓶)，10001支(瓶)以上者抽检40支(瓶)。

5.2.1.2 每瓶装量在20ml以上的冻干血液制品，每柜冻干200瓶以下者抽检2瓶，200瓶及以上者抽检4瓶。

每瓶装量6～20ml抽检数量加倍。

5ml和5ml以下者按5.2.1.1项抽检。

5.2.2 上市制品监督抽验量
5.2.2.1 除血液制品外，其他生物制品每批抽检8支(瓶)。

5.2.2.2 血液制品每瓶装量在50ml以下，抽检6瓶，50ml或50ml以上抽2瓶。

表每支(瓶)注射剂抽验量
每支(瓶)制品装量
(ml)
＜0.5
0.5≤V＜5
5≤V＜20
20≤V＜100
每支(瓶)抽验量
(ml)
全量
0.5
1.0
5.0
6 检查法
无菌检查法包括直接接种法及薄膜过滤法。

如供试品性状允许，可优先采用薄膜过滤法。

6．1 直接接种法
6.1.1 含防腐剂的制品，应先增菌。

按5. 2项抽取的供试品按上表逐瓶取样，并按每20支安瓿混合后接种。

应接种培养基瓶数依供试品混合量（全部接种）而定。

接种量与培养基的比例：用苯酚或氯仿作防腐剂者至少为1∶20，用汞作防腐剂者或制品内含有甲醛、抗生素者至少为1∶50。

将混合供试品先按此比例接种于流体硫乙醇酸盐培养基1 内增菌，增菌培养基不得少于200ml（扁瓶）。

于20～25℃培养3～4天后移种至流体硫乙醇酸盐培养基1、适宜的营养琼脂斜面、改良马丁培养基各2管，每管0.5 ml。

将流体硫乙醇酸盐培养基1、适宜的营养琼脂斜面各1管置30～35℃培养，其余各管置20～25℃培养，增菌管及移种管培养时间全程不得少于14天。

6.1.2 不含防腐剂制品，不经增菌。

按5.2项及上表将每批（或亚批）抽检供试品逐瓶取样混合，装量在5.0ml 以下者(包括5.0ml)每10瓶（安瓿）混合，装量在5.0ml以上者每7瓶（安瓿）混合，应接种培养基管数依供试品混合量（全部接种）而定。

将混合后的供试品直接接种于流体硫乙醇酸盐培养基1及改良马丁培养基培养基，接种后的流体硫乙醇酸盐培养基总数的1/2置30～35℃培养，其余置20～25℃培养，同时以0.9%无菌氯化钠溶液代替供试品，做阴性对照，培养时间不得少于14天。

6.1.3 供试品混浊和接种后不能判定结果的制品，可按上表取规定量的供试品，接种于流体硫乙醇酸盐培养基2 (200ml)内进行增菌培养，3～4天后移种。

培养基种类和管数、培养温度同6.1.1项，增菌管及移种管培养时间全程不得少于14天，然后判定结果。

6.1.4 体外诊断制品
只做半成品无菌检查。

即半成品在加防腐剂之前，除菌过滤时留样做无菌检查，用直接接种法，培养8天，观察结果。

如有菌生长，制品需经除菌处理后再做无菌检查，若再有菌生长应废弃。

如半成品已加入防腐剂后除菌，则应留样按含防腐剂制品用直接接种法作无菌检查。

6．2 薄膜过滤法
采用全封闭式集菌器，薄膜孔径不大于0.45μm，膜直径约50mm。

取规定抽检供试品数，（如供试品少于10ml，则先用100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液或无菌稀释液稀释，）立即在无菌条件下导入无菌薄膜过滤器内，加压或减压过滤。

含汞类防腐剂的供试品，在供试品过滤后，用0.9%无菌氯化钠溶液或其他适宜的无菌溶剂冲洗滤膜3次，每次100ml。

过滤后，两个滤器加流体硫乙醇酸盐培养基1 各100ml，另一个滤器加改良马丁培养基100ml。

一个硫乙醇酸盐培养基的滤器置30-35℃培养，其余置20-25℃培养，同时以0.9%无菌氯化钠溶液代替供试品做阴性对照。

培养时间不少于14天。

6.3 结果判定
6.3．1 无菌生长判为合格(有专门规定者除外)。

6.3.2 发现有菌生长，可复试。

复试供试品量应加倍，无菌生长判为合格。

若复试仍有菌生长，该制品判为不合格。

6.3.3 成品无菌检查不合格的亚批数占整批的30%以上时，由质量保证部门会同有关部门根据具体情况，全部或部分废弃。

附注：冻干制品应按使用说明书或标签规定的溶解液重溶后进行无菌检查。

修订说明：此附录在现行版‗无菌试验规程‘的基础上，参考《中国药典》‗无菌检查法‘及WHO相关规程进行了修订，并对全文进行了重新组合。

原规程中‗支原体检查‘部分另写成为独立的附录。

支原体检查
本法系采用培养法和指示细胞法（DNA染色法）对主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞进行支原体检查，上述两种方法应同时进行。

病毒类疫苗的病毒收获液、原液或成品的支原体检查采用培养法，必要时，亦可采用指示细胞法筛选培养基。

也可采用经国家药品检定机构认可的其他方法。

1 培养法
1． 1 仪器
适宜规格的培养箱
普通显微镜
1．2 培养基种类及处方
1．2．1 肺炎支原体肉汤培养基
猪胃消化液 500ml
牛肉浸液 500ml
酵母浸粉 5 g
氯化钠 2.5g
葡萄糖 5g
酚红 0.02g
将上述成分混合溶解，于121℃高压灭菌15分钟。

使用时，于80ml内加入：
青霉素G溶液(10万U/ml) 1.0ml
1%醋酸铊溶液 2.0ml
无支原体马血清 20ml
最终pH值 7.6±0.2
1．2．2 精氨酸支原体肉汤培养基
猪胃消化液 500ml
牛肉浸液 500ml
酵母浸粉 5 g
氯化钠 2.5g
葡萄糖 5g
L-精氨酸 2g
酚红 0.02g
将上述成分混合溶解，于121℃高压灭菌15分钟。

使用时，于80ml内加入：
青霉素G溶液(10万U/ml) 1.0ml
1%醋酸铊溶液 2.0ml
无支原体马血清 20ml
最终pH值 7.1±0.2
1．2.3 支原体半固体培养基
将2.1.1.1培养基中酚红去掉，加入3g琼脂即为半固体培养基。

1．2．4 支原体琼脂培养基
将2.1.1.1培养基中酚红去掉，加入13-15g琼脂即为支原体琼脂培养基。

1．3 支原体检查用培养基灵敏度检查（变色单位试验法）
1．3．1 菌种
肺炎支原体(ATCC 1533株)，口腔支原体(ATCC 23714株)。

由国家药品检定机构分发。

1．3．2 培养基
凡应用于检查支原体的培养基都应进行变色单位试验。

1．3．3 操作
凡操作支原体应在专门的无菌操作室内进行。

将菌种接种于被检的支原体培养基，经35～37℃培养至培养基变色，盲传两代后，将培养物接种到被试培养基中，作10倍系列稀释，肺炎支原体稀释至10-7～10-9，接种在肺炎支原体肉汤培养基内；口腔支原体稀释到10-3～10-5 ，接种在精氨酸支原体肉汤培养基内，每个稀释度3支试管，置35～37℃培养7～14天观察培养基变色结果。

1．3. 4 结果判定
以接种稀释后培养基管数的2/3以上呈现生长变色的最高稀释度为变色单位判定标准。

培养基的灵敏度：肺炎支原体(ATCC1533株)变色单位应达到10-8，口腔支原体(ATCC23714株)应达到10-4。

附注：质量检定部门应会同培养基制造部门定期抽检支原体培养基灵敏度。

1．4 供试品检查
1．4．1 抽样量
按―无菌检查法‖进行。

应对半成品按亚批抽样检查，成品可不再做。

1． 4. 2 方法及步骤
供试品如在24小时以内进行支原体检查者可贮存于2～8℃；超过24小时才能接种者，供试品应在-20℃以下贮存。

检查支原体采用支原体半流体和液体培养基。

半流体培养基在使用前煮沸10～15分钟，冷却至56℃左右，加入未灭活马血清或灭活小牛血清和酵母浸液(培养基∶血清∶酵母浸液为7∶2∶1)，并可酌情加入适量青霉素或醋酸铊，充分摇匀。

液体培养除无需煮沸外亦应同样补加上述成分。

将供试品0.5～1.0ml分别种入每支10ml半流体(已冷至35～37℃)和10ml液体培养基中，每种培养基接种4支，置35～37℃培养21天。

于接种后的第7天取4支中的2支进行次代培养，每一培养基转种半流体及液体培养基各2支，置35～37℃下培养21天，每隔3天观察一次。

1.4.3 结果判定
在培养结束时，如已接种的培养基均无支原体生长，则供试品为合格；如有支原体生长，可用两倍的接种量和培养基进行重试，如无支原体生长，供试品为合格，如仍有支原体生长，供试品判为不合格。

2．指示细胞培养法(DNA染色法)
供试品接种于指示细胞(无污染的Vero细胞或经国家药品检定机构认可的其他细胞)培养后，用特异荧光染料染色。

如供试品污染支原体，则附在细胞表面的支原体DNA着色，在荧光显微镜下可判定。

2．1 仪器
适宜规格的荧光显微镜
适宜规格的二氧化碳孵箱
六孔细胞培养板或其他容器
2．2．培养基及指示细胞
DMEM完全培养基
DMEM无抗生素培养基
指示细胞（已证明无支原体污染的Vero细胞或其他传代细胞）
2．3 试剂
2..
3.1 二苯甲酰胺荧光染料（Hoechst 33258）浓缩液：
称取5 mg二苯甲酰胺荧光染料加入100 ml 不含酚红和碳酸氢钠的Hank‘s平衡盐溶液中，在室温下用磁力搅拌30～40分钟，使完全溶解，避光-20℃保存。

2.3.2 二苯甲酰胺荧光染料工作液
取1 ml上述浓缩液，加至100ml无酚红和碳酸氢钠的Hank‘s溶液中。

2.3.3 固定液
乙酸:甲醇（1:3）溶液为细胞固定液。

2.3.4 封片液
0.1mol/L柠檬酸 22.2ml
0.2mol/L Na2HP4·12H2O 27.8ml
甘油 50.0ml
以上三者混匀，调pH 至5.5。

2. 4供试品检查
2.4.1 供试品的处理
2.4.1.1 细胞培养物：将待检细胞经无抗生素培养基传三代，然后取细胞已长满的且三天未换液的细胞培养上清液，待检。

2.4.1.2 毒种悬液：如该毒种对指示细胞可形成病变并影响结果判定时，应用对支原体无抑制作用的特异抗血清中和病毒后或用不产生细胞病变的另一种指示细胞进行检查。

2.4.1.3 其他供试品：应选用该供试品对细胞生长无影响的细胞作为指示细胞进行检查。

2.4.2 指示细胞的制备
取成片Vero细胞消化后，制成1 x105个/ml的细胞悬液，每孔0.5ml接种6孔细胞培养板或其他容器，每孔加无抗生素培养基3 ml，于5% 二氧化碳孵箱 37℃培养过夜。

2. 4. 3 方法及步骤
于指示细胞培养板中依次加供试品、阴性对照及阳性对照包括；
阴性对照加无抗生素培养基2ml；
阳性对照可选已知阳性的供试品标准菌株；
待检细胞培养上清液2ml；
或毒种或其他供试品至少1ml。

5% 二氧化碳孵箱 37℃培养3～5天。

指示细胞培养物至少传代1次；末次传代培养用含盖玻片的6孔培养板培养3～5天。

取出培养板，吸出培养孔中的培养液，加入固定液5ml，放置5分钟。

吸出固定液，再加5ml固定液固定10分钟。

吸出固定液，使盖玻片在空气中干燥。

加 Hoechst 33258 染料（或其他DNA染料）工作液5ml，加盖，室温下放置30分钟。

吸出染液，每孔加5 ml 蒸馏水，洗3次。

吸出蒸馏水，盖玻片于空气中干燥。

取洁净载玻片加封片液一滴，分别将盖玻片面向下盖在封片液上制成封片。

用荧光显微镜观察。

2. 4. 4 结果判定
2.4.4.1 阴性结果：仅见指示细胞的细胞核呈现黄绿色荧光。

2.4.4.2 阳性结果：荧光显微镜下细胞外可见大小不等、不规则的荧光着色颗粒。

当阴性及阳性对照结果均成立时，试验有效。

如未证明供试品有支原体存在，则供试品为合格；如发现供试品为阳性或可疑时，应进行重试；如仍阳性时，供试品判为不合格。

修订说明：此附录在现行版‗无菌试验规程‘的基础上，参考WHO相关规程进行了修订，并对全文进行了重新组合，并成为独立附录。

病毒外源因子检查法
病毒类制品在毒种选育和生产过程中，经常使用动物或细胞培养基质，所以，有可能造成外源因子（特别是外源病毒因子）的污染。

为了保证产品质量，需要对毒种和细胞进行外源因子的检测。

A. 病毒种子批外源因子检查
对病毒主种子批或工作种子批，应取样进行病毒外因子检测，其取样量应足够检测试验的需要。

在试验前应用非人和非猴源的特异性抗体，中和本病毒。

所用抗体应用与生产疫苗（或制品）不同种的无外源因子污染的细胞（或动物）制备的免疫原生产的抗血清（或单克隆抗体）。

如果病毒曾在禽类组织或细胞中繁殖过，则抗体不能用禽类来制备。

若用鸡胚，应来自SPF鸡群。

1. 动物试验法
1.1小鼠。

取15~20g小鼠至少10只，用经中和后的病毒悬液，每只脑内接种0.03ml，腹腔接种0.5ml。

至少观察21天。

解剖所有在试验24小时后死亡或有患病体征的小鼠，为了检查病毒感染的证据，直接肉眼观察其病理改变，并将有病变的相应的组织悬液通过脑内和腹腔接种另外至少5只小鼠并观察21天。

如果没有小鼠表现出病毒感染现象，则病毒种子批符合要求。

在观察期内至少有80%最初接种的小鼠存活试验才有效。

1.2乳鼠。

出生后24小时以内的乳鼠，至少10只，用经中和后的病毒悬液，脑内接种0.01ml，腹腔接种至少0.1ml。

每天观察，至少14天。

解剖所有在试验24小时后死亡或有患病体征的小鼠，直接肉眼观察其病理改变，并取有病变的相应的组织和脑、脾制备成悬液脑内和腹腔接种另外至少5只小鼠并每天观察，观察14天。

如果没有小鼠表现出有病毒感染现象，该种子批通过试验。

在观察期内至少有80%最初接种的小鼠存活试验才有效。

2. 细胞培养法
2.1非血吸附病毒检查
中和后的病毒悬液，还应分别接种于人源、猴源和生产用的同种不同批的细胞。

如果是利用人二倍体细胞生产的，还应接种另外一株人二倍体细胞。

每种细胞最少接种6瓶，每瓶病毒悬液接种量不少于培养液总量的25%。

于36±1℃培养，观察二周，或最后一次收获病毒液时间检查是否有CPE出现。

未见CPE为阴性。

2.2血吸附病毒检查
于第6~8天和第14天，每种细胞分别各取出2瓶进行血吸附病毒检查。

用0.2%~0.5%豚鼠红细胞悬液覆盖于细胞表面，一瓶放2~8℃，一瓶放20~25℃，30分钟后显微镜下观察，未见血球吸附现象为阴性。

3.鸡胚检查法
在禽类组织或细胞中繁殖过的病毒种子需用鸡胚检查禽类病毒的污染。

选用9~11和5~7日龄SPF鸡胚最少每组5只，分别于尿囊腔和卵黄囊途径接种每胚0.5ml经过中和后的病毒悬液。

孵育7日后，取尿囊液用豚鼠和鸡红细胞做血球凝集试验应为阴性。

被接种的鸡胚至少80%存活7天试验有效。

B. 生产用对照细胞外源因子检查
1.非血吸附病毒检查
1.1细胞直接观察
每批生产用细胞应留取5%（不少于500ml），分种于若干培养瓶中，加入与疫苗生产相同的细胞维持液，在与疫苗生产相同的条件下培养，观察14天，在显微镜下观察，是否有CPE出现，无CPE出现者为阴性。

在观察期末至少要80%的对照细胞培养物存活试验成立。

1.2细胞培养试验
对照细胞在观察期末，收取上清液混合后取适量接种于猴源和人源的细胞培养物，如果疫苗病毒在非猴或非人源其他细胞系上生产，还应接种于同种不同批细胞。

接种量应不少于总量的25%。

每种细胞至少检查5ml上清混合液。

在36±1℃培养，如生产的细胞培养条件不是36±1℃，则应选用与生产相同的培养条件进行。

并连续观察14天，或最后到收获液的时间仍无CPE者为阴性。

2.血吸附病毒检查
对1.1、1.2细胞培养物在观察期末取至少25%的细胞培养瓶进行血吸附病毒检查。

（方法见A.2.2项）
修订说明：此规程根据欧洲药典（2000版）修订。

热原质检查法
本法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。

1 供试用家兔
1.1 供试用的家兔应健康合格，体重1.7~
2.5kg, 雌兔应无孕。

1.2 预测体温前7日即应用同一饲料饲养，在此期间内，体重应不减轻，精神、食欲、排泄等不得有异常现象。

1.3 未曾用于热原质试验的家兔，应在检查供试品前3~7日内预测体温,进行挑选。

挑选试验的条件与检查供试品时相同，仅不注射药液，每隔30分钟测量体温1次，共测8次，8次体温均在38.0~39.6℃的范围内,且最高与最低体温差不超过0.4℃的家兔,方可供热原质试验用。

1.4 凡热原质试验用过的家兔，若供试品判为符合规定，家兔至少休息48小时后可重复使用。

对血液制品、抗毒素和其他同一过敏原的供试品在5天内可重复使用。

2 试验前准备
2.1 试验用的注射器、针头及一切与供试品接触的器皿，应置烘箱中用250℃加热30分钟或用180℃加热2小时，也可用其他适宜方法除热原质。

2.2 测温探头的精密度应为±0.1℃。

探头插入肛门的深度和时间各兔应相同，深度一般约6cm，时间不得少于2分钟。

2.3 热原质试验前1~2日，供试验用家兔应尽可能处于同一温度的环境中，实验室和饲养室的温度相差不得大于5℃，实验室温度应在17～25℃，试验全过程室温变化不得大于3℃，并应保持安静，避免强光照射，避免引起动物骚动（包括噪声干扰）。

空气中氨含量应低于20mg/L。

3 试验
3.1 供试品
供试品或稀释供试品的无热原质注射液，在注射前应预热至38℃。

供试品的注射剂量见各制品规程的规定。

但家兔每1kg体重注射体积不得少于0.5ml，不得大于10ml。

3.2 每批供试品初试用3只家兔，复试用5只家兔。

3.3 家兔在试验前至少2小时开始停止给食并置于适宜装置中，直至试验完毕。

家兔固定30～60分钟后开始检温，间隔30分种测量体温1次，一般测量2次，两次体温之差不得超过0.2℃,以此两次体温的平均值作为该兔的正常体温。

当日使用的家兔，正常体温应在38.0℃~39.6℃的笵围内,同组兔间正常体温之差不得大于1℃。

3.4 测定其正常体温后15分钟以内，自耳静脉缓缓注入规定剂量并预热至38℃的供试品溶液，然后每隔30分钟测量其体温一次，连测6次。

3.5 若第6次较第5次升温超过0.2℃并超过正常体温时，应连续测量，直至与前一次相比升温不超过0.2℃。

4 结果判定
每只兔的正常体温与注射供试品后最高升温之差，为该兔的应答。

出现负值以零计算。

4.1 初试结果判定
4.1.1 符合下列情况者，判为合格：
3只家兔体温升高均低于0.6℃,并且3只家兔体温升高总和不超过1.4℃。

4.1.2 有下列情况之一者，复试一次：
3只家兔中，有1只家兔体温升高0.6℃或0.6℃以上；或3只家兔体温升高总和超过1.4℃。

4.2 复试结果判定。