复合模板印迹聚合物净化液相色谱-质谱联用法测定鱼肉中氟喹诺酮类残留

复合模板印迹聚合物净化液相色谱-质谱联用法测定鱼肉中氟
喹诺酮类残留
刘芃岩;申杰;刘磊
【摘要】The molecularly imprinted polymer (MIP) has been prepared using levofloxacin and cipro-floxacin as the mixed-templates, a-methacrylic acid (MAA) as functional monomers and trimethylol-propane trimethylacrylate (TRIM) as crosslinker. A method has been established for simultaneous determination of residues of ten fluoroquinolones in grass carp by high performance liquid chromatog-raphy-ion trap mass spectrometry (HPLC-ITMS) combining with molecularly imprinted polymer solid phase extraction (MISPE). The samples were extracted with 2% acetic acid in acetonitrile and defatted with n-hexane, then purified by the self-made molecularly imprinted cartridge. The preparation of samples and the separation conditions had been optimized, HPLC was performed with a gradi-ent elution program while acetonitrile and water (containing 0. 05% formic acid) were used as mobile phase. The identification and quantification were done with ion trap mass spectrometry. The recove-ries ranged from 80. 6% to 104. 6% with a relative standard deviations of 8. 6%. The limits of detec-tion (LOD) were 0. 11-0. 25 ug/kg and the limits of quantification (LOQ) were 0. 35 0. 84 u.g/kg. This method is suitable for validation and multi-residue analysis of fluoroquoloncs in aquatic products.%同时以左氧氟沙星和环丙沙星为模板分子,α-甲基丙烯酸( MAA)为功能单体,三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)为交联剂,合成了复合模板分子印迹聚
合物,建立了以此聚合物为分子印迹固相萃取(MISPE)富集净化样品,结合高效液相
色谱-离子阱质谱(HPLC-ITMS)同时测定鱼肉中10种氟喹诺酮类药物残留量的方法.采用2％醋酸乙腈提取样品,提取液经正己烷脱脂后,过自制的复合模板分子印迹固相萃取柱净化,以0.05％甲酸溶液和乙腈为流动相,梯度洗脱程序进行色谱分离,离子阱质谱进行定性和定量分析.方法的回收率为80.6％～104.6％,相对标准偏差小
于8.6％(n=3)；检出限(LOD)为0.11～0.25 μg/kg;定量限(LOQ)为0.35～0.84
μg/kg,可以满足水产品中氟喹诺酮类药物的确证和多残留分析的要求.
【期刊名称】《分析化学》
【年(卷),期】2012(040)005
【总页数】6页(P693-698)
【关键词】高效液相色谱-离子阱质谱;复合模板印迹聚合物;氟喹诺酮
【作者】刘芃岩;申杰;刘磊
【作者单位】河北大学化学与环境科学学院,保定071002;河北大学化学与环境科
学学院,保定071002;河北大学化学与环境科学学院,保定071002
【正文语种】中文
氟喹诺酮类药物（FQs）是人类继磺胺类药物之后在抗菌药物合成方面最重要的突破，因其具有高效，低毒，组织穿透力强及价格低廉等特点，被广泛应用于动物养殖中。

但随着该类药物的大量和非科学地使用，造成其在动物体内残留，并通过食物链进入人体，从而影响人体健康。

因此，动物体内的FQs的残留检测备受关注。

由于食品基质复杂，提取净化方法的优劣成为测定结果准确与否的关键。

分子印迹聚合物因其具有良好的选择性，作为固相萃取材料正逐渐应用于食品中FQs的残
留检测［1］。

分子印迹固相萃取（MISPE）技术是一种新的萃取方法，应用于不同基质样品中的FQs分析中，如环境样品（土壤［2，3］，河水［4］），生物
样品（尿液［5，6］）和动物性食品［7］等。

上述报道中均使用氟喹诺酮单模板分子印迹聚合物，综述文献［1］中介绍的也均为单模板印迹聚合物。

理论上，分子印迹聚合物仅对印迹分子具有选择吸附，使得单模板分子聚合物分离富集目标化合物的种类受到限制，复合模板或多模板印迹聚合物［8～12］是以两种分子或多种分子为模板制备的聚合物。

由于聚合物的选择性和亲和力与模板分子的刚性和空间位阻有关，用结构类似的分子共同作为模板，会使结合位点的识别能力扩大，这样使聚合物既有分子印迹聚合物的选择性，又使聚合物对同类物有着更高的亲和力，使应用范围扩大，这种性质正好可用于多残留分析中。

本实验在前期工作基础上［13，14］，以左氧氟沙星和环丙沙星为模板分子，制
备了复合模板分子印迹聚合物。

此聚合物对FQs具有理想的净化效果和良好的选
择性，利用此聚合物作为固相萃取材料对样品中氟喹诺酮类进行分离净化，再结合高灵敏的高效液相色谱－离子阱质谱联用技术（HPLC－ITMS），建立了同时测定鱼肉中10种FQs残留的方法。

方法的回收率（80.6%～104.6%）和检出限
（0.11～0.25 μg／kg）令人满意，实验结果可靠，准确，可满足水产品中痕量FQs多残留检测的需要。

Agilent1200高效液相色谱－G6310离子阱质谱（配有电喷雾离子源，ESI）联用仪，色谱柱：Agilent HC－C18（250mm×4.6mm，5μm，美国安捷伦公司）；LG10－2.4A离心机（北京雷勃尔离心机有限公司）；WH－861涡旋混合器（太仓华利达实验室设备有限公司）；THZ－82恒温水浴振荡器（常州国华电器有限
公司）；BF－2000M型氮气吹干仪（北京八方世纪科技有限公司）。

环丙沙星（CIP），左氧氟沙星（LVFX），依诺沙星（ENO），诺氟沙星（NOR），恩诺沙星（ENR），氟罗沙星（FLX），洛美沙星（LOM），培氟沙
星（PEF），加替沙星（GAT）及司帕沙星（SPA）购自中国药品生物制品检定所；α－甲基丙烯酸（MAA，分析纯）和甲酸（色谱纯）购自天津市科密欧化学试剂
开发中心；三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯（TRIM，分析纯，天津市天骄化学试剂
有限公司）；甲苯（分析纯，天津市北方天医化学试剂厂）；偶氮二异丁腈（AIBN，化学纯，上海试四赫维化工有限公司）；甲醇（色谱纯，天津市康科德
科技有限公司）；甲醇、乙酸（分析纯，天津市北联精细化学品开发有限公司）；水为二次蒸馏去离子水。

0.05 %甲酸溶液，过0.45μm滤膜。

分别准确称取适量10种FQs标准品，用甲醇配制成250mg／L的单标储备液，
于-18℃保存，使用期为3个月。

准确量取适量10种单标储备液，用甲醇稀释配制成10mg／L的混合标准工作液，于4℃保存，使用期为1个月。

移取10mg／L的混合标准工作液，用流动相稀释成浓度为0.1，0.5和1.0mg／L标准工作液，于4℃保存。

Agilent HC－C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相A：乙腈，流动
相B：0.05%甲酸溶液；流速：1.0mL／min；分流比：1：2；检测波长：281nm；柱温：40℃；进样体积：10μL。

10种抗生素的梯度洗脱程序：0～9min，12%A；9～12min，12%～14%A；12～17min，14%～15%A；17～22min，15%～19%A；22～28min，19%～23%A；28～35min，23%～12%A。

电喷雾离子源（ESI），电离方式：ESI＋，扫描范围：m／z 100～400；雾化气
压力：0.24MPa；毛细管电压：3.5kV，碎裂电压：1V；干燥气温度：350℃；干燥气（氮气）流量：12L／min。

在10种氟喹诺酮中，选择具有代表性结构的环丙沙星和左氧氟沙星为印迹分子，制备了双模板分子印迹聚合物：将适量模板分子环丙沙星和左氧氟沙星（摩尔比1∶1）及功能单体α－甲基丙烯酸（MAA）溶于甲苯中，超声，使模板分子和功
能单体混匀并充分作用，再加入三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯（TRIM）和偶氮二
异丁腈（AIBN），超声，通氮气后密封，于60℃水浴中聚合24h，将得到聚合物研磨并过筛，使其粒径在54～74μm之间，然后加入适量甲醇－乙酸（8∶2，V
／V）溶液，经超声洗脱模板分子。

最后用甲醇洗去残留的乙酸，直至中性，得到分子印迹聚合物（MIP）。

非印迹聚合物（NIP）的制备步骤除不加模板分子外，其余步骤同上。

通过吸附性能和平衡吸附实验，并与NIP对比，说明此聚合物对
于环丙沙星和左氧氟沙星同时具有选择吸附性能。

称取分子印迹聚合物颗粒200mg于3mL空管中，制成固相萃取小柱。

用3.0mL
甲醇和3.0mL水活化；加入1mL待测溶液，3.0mL水淋洗柱体；再用3.0mL 4%氨水－甲醇溶液洗脱；收集洗脱液于玻璃离心管中，于45℃下以氮吹至干，加
1.0mL流动相，过0.2μm滤膜。

称取（5.00±0.01）g已预先搅碎的肉样于50mL塑料离心管中，放入冰箱中冷冻备用。

样品处理时从冰箱中取出，待室温下解冻后，向肉样中加入8mL提取液（2%醋酸－乙腈溶液），涡旋混匀90s，暗处静置20min，超声提取10min，以9500r／min离心10min，取出上清液转移至另一干净离心管中；用8mL提取液重复提取一次。

将两次提取液再离心后，移取8mL上清液于15mL塑料离心管中，在60℃，以氮气吹至近2mL；以6mL正己烷萃取脱脂，将下层于60℃继续氮吹至约1mL，注入预先活化的分子印迹固相萃取小柱，按上述步骤净化后，待测。

在液相色谱－质谱联用技术中，流动相经常包含挥发性酸的水溶液。

在流动相中加入少量酸，不仅能抑制峰拖尾，改善峰形，还能在一定程度上提高FQs的质子化
效率，增强质谱测定时的灵敏度。

实验表明，在添加量相同时，甲酸比乙酸的质子化效率高。

本研究选用0.05%甲酸溶液作为流动相中的水相组成部分。

通过调节0.05%甲酸溶液和乙腈的比例发现，单一的配比不能使10种FQs完全分离，乙腈比例高时，目标分析物出峰时间过于接近或重叠；乙腈比例低时，分析程序时间太
长，不利于测定。

因此，本研究通过建立梯度洗脱程序，将保留时间接近的化合物分离。

在优化梯度洗脱程序的过程中，诺氟沙星和左氧氟沙星的保留时间总是非常接近。

但是，在质谱检测时，这两种物质各自的母离子及碎片离子均完全不同。

因此，并不影响准确的定性和定量分析，优化后的梯度程序见2.3节。

将一定浓度的FQs混合标准溶液注入色谱－质谱联用仪，进行全扫描，得到每种
药物的分子离子峰［M＋H］＋。

对每种药物的［M＋H］＋进行二级质谱（MS2）扫描，得到碎片离子峰，通过分析二级质谱信息来确定每种药物的特征碎片离子。

由图1可见，FQs的二级碎片离子主要表现为中性丢失，如脱去羧基（CO2），
氟（HF），哌嗪（如C2H5N）和羰基（CO）等的碎片离子，其中脱羧峰（［M
＋H－CO2］＋），脱羧脱氟峰（［M＋H－CO2-HF］＋）及脱羧基后哌嗪环断
裂重排的产物（［M＋H－CO2－C2H4NR］＋）是最常见的二级特征碎片离子，与文献［15，16］一致。

二级质谱的裂解位置及质谱参数见表1。

结合目标物质
的分子离子峰及其二级特征碎片离子峰，即可对10种药物进行准确的定性分析。

FQs类物质的分子结构中均存在着叔胺基和羧基，易溶于酸性或碱性溶剂。

由于
乙腈极佳的沉淀蛋白能力及容易浓缩等特点，本研究考察了乙腈，2%氨水乙腈以
及2%醋酸乙腈3种提取液，加入氨水之后的乙腈其提取效率（36.3%～53.6%）反而不如纯乙腈（49.3%～68.8%）；而醋酸乙腈的提取效率（76.9%～92.4%）又明显高于纯乙腈，最终本研究将2%醋酸乙腈确定为样品提取液。

应用离子阱质谱检测器测定鱼肉样品，在样品中未检出待测目标物质。

对鱼肉样品进行添加回收实验，分别添加100和20μg／kg的10种氟喹诺酮的标准溶液，
每个加标水平平行3份。

以加标水平20μg／kg为标准，以3倍信噪比计算方法
的检出限（LOD）；根据10倍信噪比计算方法的定量限（LOQ）。

10种氟喹诺
酮类药物的添加回收率为80.6%～104.6%；RSD＜8.6%；检出限（LOD）为
0.11～0.25μg／kg（湿重）；定量限（LOQ）为0.35～0.84μg／kg（湿重），
方法的回收率及检出限令人满意。

鱼肉样加标样品的总离子流图见图2。

由图2可知，经复合模板分子印迹聚合物的固相萃取后，样品的净化效果良好，未见干扰。

方法的回收率，精密度，检出限及定量限见表2。

同时以左氧氟沙星和环丙沙星为模板分子合成了复合模板印迹聚合物，通过吸附特性实验，显示了良好的识别能力和较高的亲和力，将此聚合物作为固相萃取材料用于草鱼中10种FQs（ENO，FLX，NOR，LVFX，PEF，CIP，LOM，ENR，GAT 和SPA）的萃取，富集净化效果良好，与单模板分子印迹聚合物只选择吸附单一
物质相比，可同时吸附和解吸一类物质，更适合于多残留药物的同时分离富集。

用上述材料富集净化FQs后，以液相色谱－离子阱质谱联用检测方法同时测定了鱼
肉中的10种FQs，获得并分析了药物的一级和二级质谱信息，确定了10种药物的特征碎片离子，充分发挥了质谱的高灵敏度及选择性。

本方法灵敏、准确、重现性好，符合国内外对动物组织中FQs最大残留限量的要求（10～500μg／kg）［17，18］，适于动物组织样品中FQs的日常残留检测与确证分析。

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