乙醇脱氢酶3及细胞色素P450 2E1基因多态性与酒精性肝病无关

乙醇脱氢酶3及细胞色素P450 2E1基因多态性与酒精
性肝病无关
周文婷，李景鹏*，崔羽，王晓燕
东北农业大学 150030
摘 要：目的 研究乙醇脱氢酶3 (ADH3)及细胞色素P450 2E1 (CYP2E1)基因多态性与酒精性肝病(ALD)的关系，探讨遗传因素对其易感性的影响。

方法 应用PCR-RFLP法检测北方汉族男性健康者、嗜酒者及ALD患者中ADH3和CYP2E1的基因型并比较其基因频率。

结果 ADH3及CYP2E1的两种等位基因在上述三组间的频率差异均无显著性。

三组中均以ADH3*1/3*1和c1/c1基因型为主，基因型ADH3*2/3*2及c2/c2的分布极低。

结论 ADH3及CYP2E1基因多态性与北方汉族男性ALD的产生无关。

关键词：乙醇脱氢酶，细胞色素P450，基因多态性，酒精性，肝疾病
遗传因素与酒精性肝病（alcoholic liver disease, ALD）是否相关？这一问题困扰人们相当长的时间。

在一项关于孪生子患酒精性肝硬化的发生率的研究中发现，单卵双胞胎与双卵双胞胎相比有较高发生率，提示个体间遗传差异是酗酒者ALD易感性的基础[1]。

虽然与ALD 相关的特定基因尚未发现，但有证据显示乙醇代谢酶基因多态性与此有关。

乙醇脱氢酶
3(alcohol dehydrogenase 3，ADH3)、乙醛脱氢酶2（aldehyde dehydrogenase 2，ALDH2）和细胞色素P450 2E1 (cytochrome P450 2E1, CYP2E1)是酒精代谢中的关键酶，均存在基因多态现象。

因国内已有ADH2及ALDH2基因多态性与ALD易感性的相关报道[2-3]，ADH3及CYP2E1基因多态性与ALD关系的研究却十分有限，故我们通过检测健康者、嗜酒者及ALD患者中ADH3和CYP2E1的分布频率并进行比较，较全面地探讨ADH3及CYP2E1基因多态性对汉族男性ALD易感性的影响，从而为ALD的基因检测提供可行的方法并为今后ALD的进一步研究提供依据。

1 材料与方法
1．实验对象与样本收集：健康大学生（日饮酒量＜10g，无肝病史）50例，嗜酒无肝病者50例，ALD患者50例，均经哈尔滨医科大学附属第四医院临床确诊，诊断标准参照文献[4]。

所有研究对象均为我国北方地区汉族男性，彼此无血缘关系。

空腹抽取静脉血5mL,
EDTA-Na2抗凝，分离出白细胞，-20℃保存。

2．方法：(1)基因组DNA制备：饱和酚法从白细胞中提取DNA。

(2)PCR扩增：检测ADH3第8外显子SspⅠ位点多态性的引物为：P1 5’-GCGAGTAAAGAATCTGTCCCCA -3’和P2 5’-TTTCCAGAGCGAAGCAGGTC-3’， PCR反应参数为：94℃预变性5min，然后94℃变性1min, 52℃退火1min, 72℃延伸1min，进行35个循环，最后72℃延伸7min。

检测CYP2E1 5’端非编码区 RsaⅠ/ PstⅠ位点多态性的引物为：P3 5’-CCAGTCGAGTCTACATTGTCA-3’和P4 5’-TTCATTCTGTCTTCTAACTGG- 3 ’。

PCR反应条件为：94℃预变性5min，而后94℃变性1min, 60℃退火1min, 72℃延伸1min，进行35个循环，最后72℃延伸7min。

(3)酶切与电泳：上述PCR产物分别用SspⅠ和PstⅠ消化过夜，4%琼脂糖凝胶上电泳。

3．统计学分析：用Mantel-Hanensze χ2检验基因型及等位基因频率差异，应用SAS 6.12软件包完成统计分析。

2 结果
1．ADH3和CYP2E1多态位点各基因型电泳检测结果：见图1。

野生型ADH3*1/3*1被SspⅠ酶切后产生78bp和53bp两条片段，突变型ADH3*2/3*2因缺失SspⅠ位点，酶切产物仅为一条131bp片段,杂合型ADH3*1/3*2酶切后则分别产生131bp，78bp和53bp三条片段。

在CYP2E1 RsaⅠ/PstⅠ位点，野生型c1/c1因缺失PstⅠ酶切位点，酶切后仅410bp一条片段；突变型c2/ c2用PstⅠ消化产生290bp和120bp两条片段；杂合型c1/ c2酶切后产生410、290、120bp三个片段。

2．ADH3的基因型与等位基因分布频率：由表1可见，ADH3的三种基因型及两种等位基因在对照组与嗜酒组间、对照组与ALD组间及嗜酒组与ALD组间的频率均无显著差异。

3. CYP2E1的基因型与等位基因分布频率：表3列出了在RsaⅠ/PstⅠ位点，CYP2E1的三种基因型与两种等位基因在三组研究对象间的频率，结果发现各基因型与等位基因在各组中的频率均极相似。

4．ADH3及CYP2E1基因多态性对ALD易感性的综合影响：见表3。

因CYP2E1的c2/c2基因型在各组研究对象中频率极低，无可比性（表2），故未对其影响进行研究。

结果发现排除CYP2E1基因多态性影响后，ADH3的三种基因型及两种等位基因在对照组、嗜酒组及ALD组中的分布差异均无显著性。

a：比较在对照组与嗜酒组中进行；b：比较在对照组与ALD组中进行；c：比较在嗜酒组与ALD组中进行
3 讨论
乙醇摄入体内后，首先由ADH和CYP2E1催化生成乙醛，进而被ALDH转化为乙酸。

乙醇的代谢产物乙醛具有很强的毒性，被认为与乙醇相关疾病的发病机理密切相关[1]。

理论上，肝脏中乙醛的堆积量由ADH，CYP2E1和ALDH分别产生和消化的速度有关，而它们产生和消化乙醛速度上的差异则与基因多态性有关[5]。

ADH3和CYP2E1是酒精代谢中的关键酶。

在ADH3基因第8外显子存在限制性内切酶SspⅠ的多态位点, 从而形成ADH3的野生型ADH3*1和突变型ADH3*2两种等位基因，其中ADH3*1编码的亚基比ADH3*2编码的亚基具有较高活性。

CYP2E1基因定位于人类染色体10q24.3-ter，在它的5’非编码区存在RsaⅠ/PstⅠ位点多态，从而形成C1和C2两种等位基因。

本研究以汉族男性为研究对象，通过检测健康者、嗜酒者及ALD患者中ADH3和CYP2E1各等位基因的分布频率，探索遗传因素对汉族男性ALD易感性的影响。

结果发现，ADH3和CYP2E1的两种等位基因在上述三组中的分布均无显著差异，说明ADH3和CYP2E1基因多态性与ALD的产生无关，与Tsutsumi等[6]及Thomasson等[7]的结果不同，但与Han等[5]及Carr 等[8]的结果相同，推测与我们选取的样本量及本地环境因素等有关。

因受到数量差异、地区差异和个体差异的综合影响，使我们获得的结果与其他地区、其他研究者获得的结果出现不同、甚至矛盾。

综上，本研究较为全面地探讨了ADH3和CYP2E1遗传因素对汉族男性ALD易感性的影响，发现二者的多态性与北方汉族男性ALD的发生无关，为其今后的预防与控制提供了依据，同时也为其病理研究奠定了分子基础。

参考文献
1. Sherlock S. Alocoholic liver disease. Lancet, 1995, 345: 227-229.
2. 阎明，朱孔锡，孟繁立，等. 乙醛脱氢酶基因多态性与酒精性肝病的关系. 中华肝脏病杂志, 2003, 11: 654-656
3. 虞朝辉，厉有名，陈卫星，等. 芯片检测乙醇代谢相关酶基因多态性及其在酒精性肝病中的应用. 中华医学杂志, 2002, 115(7) : 1085-1087
4. 厉有名. 酒精性肝病的分类及其诊断标准的若干问题. 中华消化杂志, 2002, 22: 38-39
5. Han Chu Lee, Hyo-Suk Lee, Sook-Hyang Jung, et al. Association Between Polymorphisms of
Ethanol-Metabolizing Enzymes and Susceptibility to Alcoholic Cirrhosis in a Korean Male Population. J Korean Med Sci,2001, 16: 745-750
6. Tsutsumi M. Genetic factors related to the development of cancinoma in digestive organs in alcoholics [J ]. Alcohol and Alcoholism, 1993, 28 (S1B): 21-26
7. Thomasson HR, Crabb DW, Edenberg HJ,et al. Alcohol and aldehyde dehydrogenase polymorphisms and alcoholism. Behav Gen, 1993, 23:131–136
8. Carr LG, Yi IS, Li TK, et al. Cytochrome P4502E1 genotypes, alcoholism, and alcoholic cirrhosis in Han Chinese and Atayal Natives of Taiwan. Alcohol Clin Exp Res, 1996, 20: 43-46
No association between polymorphisms of the ADH3 and CYP2E1 loci and alcoholic liver disease
ZHOU Wen-ting, LI Jing-peng*, CUI Yu, WANG Xiao-yan Life Sciences and Biotechnology Research Center, Northeast Agriculture University, Harbin,
150030, China.
Corresponding author: LI Jing-peng, E-mail：ljingpeng@
Abstract
Objectives To study the relationship between polymorphisms at the alcohol dehydrogenases 3 (ADH3) and cytochrome P450 2E1(CYP2E1) loci and alcoholic liver disease (ALD), and investigate the influence of genetic factors on the susceptibilitys to it. Methodes PCR-RFLP was used to determine the genotypes and alleles frequences of ADH3 and CYP2E1 of healthy controls , alcoholics without evidence of liver disease and patients with ALD in male Han Chinese. Results The frequencies of the two alleles of ADH3 and CYP2E1 in the three groups above were similar. The genotypes of ADH3*1/3*1 and c1/c1 were predominant in the three groups , while hardly any ADH3*2/3*2 and c2/c2 could be detected . Conclusions There is no association between polymorphisms of ADH3 and CYP2E1 loci and ALD in male Han Chinese.
Keywords：Alcohol dehydrogenases; Cytochrome P450; Gene polymorphism; Alcoholic ; Liver diseases。