益生素生产技术基础知识

益生素生产技术基础知识
益生素生产技术基础知识
1、益生素简介
1.1益生素的概念
益生素是微生态调节剂的一个种类，也可叫做微生物饲料添加剂。

我国动物微生态学家和营养学家将其定义为：在动物微生态学理论的指导下，用正常微生物群成员，通过鉴定、培养、干燥等一系列工艺制成的一种活菌制剂及其代谢产物。

它可直接饲喂动物，以促进动物生产性能为目的的活菌制剂。

但也有学者认为益生素也应包括灭活菌体及代谢产物、和具有调节动物微生态平衡的其它制剂。

微生态调节剂是指能够调节动物微生态平衡、促进动物健康及生产性能的制剂，其主要包括：益生素、益生源、合生素。

益生源的概念：益生源是一种不被宿主消化，能选择性地刺激一种或几种肠内常住菌的活性或生长繁殖，并能增进宿主健康的可食用物质。

目前畜牧业用的益生源主要是低聚糖。

合生素的概念：合生素是由益生素与益生源或其它功能成份复配而成的制剂。

益生素的其它定义：
直接饲喂的微生物制品（美国食品与医药管理局）。

能够促进肠内菌群平衡，对宿主起有益作用的活菌制剂。

含活菌或死菌包括其组分和代谢产物的微生物制品，经口或其它粘膜途
径投入，旨在改善粘膜表面微生物或酶平衡，或者刺激特异性或非特异
性免疫机制的制品。

1.2益生素的种类
按制品剂型可分为：
液体剂型和固体剂型
液体剂型：一般是将发酵菌悬液（或浓缩液）与其它功能成份混合复配制成。

固体剂型：一般是将发酵液或收集的菌体附着于载体经干燥、粉碎、包装而成。

按制品所含有效微生物种类多少的不同可划分为：
单一有效菌剂，多菌复合剂。

单一有效菌剂：即有效活菌为某一种微生物构成的制剂，如乳酸菌剂、芽孢菌剂、酵母菌剂。

商品如“赐美健”等都是单一菌剂。

多菌复合剂：即有效菌是由二种或二种以上微生物构成的制剂。

国内大部分是此类型制剂。

按是否添加非微生物功能成份可分为：
单纯微生物制剂，复合制剂
单纯微生物制剂：即主要有效成份为微生物。

复合制剂：即主要有效成份由微生物和其它功能成份（如酶制剂、寡糖等）共同组成。

如：星星协力公司的产品，宝来利来的产品。

1.3 益生素生产的常用菌
1.3.1益生素生产用菌应具备的条件：
1.3.1.1必须具备的条件
（1）安全性。

生产用菌不能产生有毒有害物质。

从原则上讲，所用菌种必须进行严格的毒性试验，证实其安全性后方可使用。

（2）具有促进动物体内菌群平衡或预防失衡的功能。

1.3.1.2其它非必备条件
（1）营养功能。

能够分泌产生营养性物质或产生利于营养物质形成及吸收的物质，防止有害物积累的功能。

这对促进动物生长，保持健康
有直接的关系。

（2）具有产生抗菌物质的能力。

如产生抗菌素、有机酸等。

（3）对动物肠壁具有粘附性能和定植抗力。

此功能可使有益菌在肠道中长期发挥作用，可排斥病原菌的侵袭，是高档益生素应具备的条件。

（4）具有一定的抗逆性。

a、应能耐受胃酸、胆汁、胰液而不失活的。

b、制成品中活菌应能保持较长时间。

（5）在肠道环境内具有较好的繁殖和代谢能力。

（6）生产的可操作性。

做为一种工业制品，必须考虑生产成本及操作的可行性。

应选择易培养、易保存、特性遗传稳定、生产工艺简单的
菌株。

1.3.2 常用菌及其功能特点
1.3.
2.1乳酸菌
乳酸菌是指能发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的通称。

这个名称以分类学而言是不规范的。

益生素所用乳酸菌最好是从该动物消化道中分离获得，以利于在宿主体内定植。

由乳酸菌制得的益生素，一般为活菌制剂，但也有少数为灭活菌体与其代谢产物制成的制剂，其作用原理解释为：①灭活的菌体能与肠壁粘膜结合起到占位优势，防止有害菌的侵袭②代谢产物具有抗菌物质。

我国农业部允许用作饲料添加剂的乳酸菌有：干酪乳杆菌、植物乳杆菌、粪链球菌、屎链球菌、乳酸片球菌、嗜酸乳杆菌、乳链球菌，共七种。

乳酸菌的功能与作用机制：
（1）预防肠道功能紊乱，调节肠道菌群平衡。

乳酸菌通过自身代谢产物和其它细菌之间的相互作用调整菌群之间的
关系，维护和保证菌群最佳优势组合和组合的稳定。

这种作用主要取决
于其粘附、竞争、占位和产生抑菌物的特性。

乳酸菌可产生如下抗性物质：
①产酸。

乳酸菌在体内发酵糖类，产生大量乳酸、醋酸，使环境PH
下降，肠道处于酸环境；对病原性沙门氏菌、志贺氏菌、金黄葡萄
球菌等具有拮抗作用，抑制其生长。

②产生过氧化氢。

某些乳酸菌可产生H2O2，抑制葡萄球菌等致病的生
长，
在细菌种群间的相互竞争中占优势。

③产生酶类。

某些乳酸菌产生胞外糖苷酶，可降解肠粘膜上皮细胞的
复合多糖，由于这些糖是致病菌和细菌毒素的潜在受体，通过酶的
作用，可以防止毒素对上皮细胞的粘附和侵入。

④产生抗菌素。

许多乳酸菌产生抗菌素，可对体外多种病原菌有拮抗
作用。

⑤分解胆盐。

有些乳酸菌可将结合的胆酸分解为游离的胆酸，游离的
胆酸对细菌有较强的抑制作用。

（2）免疫复活功能。

大量研究证明，乳酸菌具有诱导干抗素、促进细胞分裂、产生体液免疫和细胞免疫的功能。

（3）营养作用。

乳酸菌发酵后产生的有机酸，可提高Ca2+、Fe3+等的利用率，促进铁和维生素D的吸收。

（4）控制内毒素。

乳酸菌可抑制肠道内腐败菌的繁殖，从而减少肠道中毒胺、靛基质、吲哚、氨、硫化氢和尿素酶的含量，使血液中毒素和氨含量下降，从而也降低了肝脏负担。

1.3.
2.2芽孢杆菌
动物肠道中另星存在芽孢杆菌，用于益生素的芽孢杆菌是肠道的过路菌，不能定植于肠道中。

现农业部允许用于饲料添加剂的芽孢杆菌有：枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌。

益生素中的芽孢杆菌具有以下功能：
(1)促进有益菌的生长。

基于“生物夺氧”学说，芽孢杆菌(好氧的)能消耗肠
道内氧气，造成厌氧环境，有利于厌氧菌生长，从而使失调的菌群平衡调整为正常状态，达到防治疾病的目的。

(注：正常情况下，动物肠道中占优势的微生物主要由厌氧菌群构成，对数平均值在99%以上)
此项功能是非常重要的，它可派生出乳酸菌的所有功能。

(2)拮抗肠道内有害菌
大量研究表明，芽孢杆菌能产生多肽类抗菌物质，抑制病原菌在肠道内繁殖。

(3) 产生多种消化酶，促进营养的吸收。

可产生蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等，参与饲料消化，促进动物生长。

(4) 增强机体免疫力，提高抗病能力。

研究发现，饲喂有益芽孢杆菌可促进机体免疫器官的生长发育，提
高机体的免疫能力。

(5) 促进动物器官的生理机能成熟，改善动物的生产性能。

研究表明，饲用有益芽孢杆菌可促进肠道结构和机能的成熟，可增强
机
体对糖原的利用程度，提高多糖代谢水平及提高蛋白质合成水
平。

1.3.
2.3酵母菌
酵母菌用于益生素：一种是活性酵母制剂，一种是酵母培养物。

酵母及其培养物的应用年代已久，开始多用作反刍动物的蛋白质资源，实践证明，酵母及其培养物对促进反刍动物生产性能有明显效果。

对其作用机理一般认为：酵母及其培养物具有刺激瘤胃微生物群生长的作用。

进而派生出：增加乳酸的利用、提高氨利用率、增加蛋白合成、稳定瘤胃PH值、提高纤维素消化率等等作用。

其能够刺激瘤胃微生物生长的原因一般解释为：含有丰富的维生素(B)、酶、多肽及未知生长因子等促进瘤胃微生物生长的物质。

现在酵母及培养物已广泛应用于各种动物的养殖中。

目前农业部允许用于益生素的酵母菌有：啤酒酵母、产朊假生酵母。

用做益生素的其它微生物还有光合细菌、曲霉、放线菌、拟杆菌、蛭弧菌等。

2、常见的生产工艺流程
根据所用菌种特点、剂型及生产条件，益生素可采用如下生产流程：
2.1液体发酵类
试管菌种
↓
菌种扩培（可用三角瓶或茄瓶）
↓菌悬液
种子罐培养
↓培养菌液
发酵罐培养
↓发酵菌液
↓↓↓↓（发酵←菌体分离载体→混合浓缩其它成份→复配
乏液）↓菌泥↓湿菌粉发↓
载体→混合（可造粒）干燥酵包
↓湿菌粉↓干菌粉液
干燥复配←其它成份↓↓
↓干菌粉↓载体→混合复配←其它成份
粉碎包装湿菌粉↓↓
↓干菌粉干燥包装
其它成份→复配复配←其它成份
↓↓
包装包装
注：对于易失活的乳酸菌，可在适当的生产环节做包被处理。

2.2固体发酵类
试管菌种
↓
菌种扩培（三角瓶液体培养或固体培养或茄瓶斜面培养）
↓种子
↓↓
发酵罐培养固体培养
固体种子
液体种子液
固体发酵
↓发酵物
干燥
↓干燥物
粉碎
↓
加其它成份→复配
↓
包装
益生素的生产从工艺过程上看很简单，但从产品功效对生产要求的角度来考虑，其生产技术变得即深遂又复杂。

3、菌种的选育、制备与管理
筛选出高性能的菌株是益生素产品的技术核心。

好的菌种及其培育、加工过程是保证益生素生态效应的基础。

如何选育或构建优良菌株，进而确定培养条件涉及多学科、多层次的理论与技术问题。

3.1菌种的选择
依微生态学原理，按来源于自然、回归于自然的准则，选出与宿主、原环境、
原微生态、原微群落相适应的菌种是最理想的。

但实际上很难做到。

当前，人们一般是从历史成果、微生物学特性、饲喂效果、生产特性等出发进行选种。

选择的菌种应具备的条件见1.3.1《益生素生产用菌应具备的条件》，但一个菌株一般不会满足所有的条件。

3.2菌种的选育
为了提高菌种的有益功能，常常需要对菌种进行改造。

菌种的改造可通过诱变或遗传工程的手段。

在一般的中小企业中诱变育种是最广泛使用的手段。

以下简要介绍诱变剂及诱变育种的步骤和方法。

3.2.1诱变剂与诱变处理
常用诱变剂大体可分为物理诱变剂、化学诱变剂和生物诱变剂三类。

物理诱变剂有：紫外线、X射线、γ－射线、快中子、α－射线、β－射线、超声波、激光等。

化学诱变剂有：碱基类似物、烷化剂及移码诱变剂等。

工业常用的有：
紫外线。

紫外线诱变的有效波长范围是200~300纳米。

紫外线所以能杀菌或诱变，主要是紫外线的作用光谱与核酸的吸收光谱一致，DNA最易受紫外线的影响。

一般诱变用紫外线由15W、30W紫外灯提供。

紫外线处理细胞悬浮液的方法：
取培养好的新鲜斜面菌种，用灭菌生理盐水洗下，倒入盛有玻璃珠的100ml 三角瓶中，充分摇动10分钟，用滤纸或脱脂棉过滤，得分散单孢子悬浮液。

调整悬浮液密度为105~106个/ml;
吸取上述孢子悬浮液4~5ml，倾于直径为9cm底部平整的平皿中，因紫外线易被水吸收，故皿内孢子悬浮液厚度不需要超过2mm。

照射前先开紫外灯20分钟，使灯的功率稳定。

培养皿置于磁力搅拌器上，放在紫外灯正中下方，距离20cm，先整个平皿照射1分钟，打开盖，并启动电磁搅拌器，照射一定时间。

关紫外灯，将照射后的孢子悬浮液涂平皿、培养。

电离辐射时，常用的电离辐射有、X射线、γ－射线、β－射线和快中子等。

它们都是电磁波，并以量子形成放射能量，作用于某物质时，产生电离作用，导致DNA结构的改变，引起突变。

X射线由X光机产生，γ－射线来自于放射性同位素及核反应堆，使用剂量一般为2~15万伦琴。

快中子来自核反应堆或加速器，使用剂量10~150千拉德。

电离辐射的使用：用薄壁小试管或塑料容器盛装待处理菌悬液或菌落，放
置在辐射源前一定距离进行照射。

然后稀释涂平皿培养。

碱基类似物，这是一类分子结构和天然碱基相似的化合物。

这些化合物作为微生物的培养基时，很容易渗入到微生物DNA分子中去，通过DNA复制而引起突变。

常用碱类似物有嘧啶、嘌呤类似物：如5－溴尿嘧啶（5－Bu或5－Fu），2－氨基嘌呤（2－Ap）等等。

碱基类似物的使用：将待处理微生物涂布于含一定浓度的碱基类似物培养基平皿上，在培养中得到处理，5－Bu或5－Fu的剂量为5~30mg/ml，如菌体经过饥饿培养，可提高碱基类似物的渗入量，诱变效果更好。

烷化剂。

烷化剂主要包括：硫芥、氮介、环氧衍生物、硫酸酯、亚硝基类化合物、重氮烷、乙撑亚胺等，是一类重要的诱变剂。

常用的烷化剂：甲基磺酸乙脂（EMS）、亚硝基胍（NTG）、硫酸二乙脂、亚硝基乙基尿、乙撑亚胺。

烷化剂的使用：（可参考相关书籍）。

3.2.2诱变育种的步骤与方法
诱变育种包括诱变和筛选两个步骤，即用诱变剂处理微生物细胞，引起突变，再通过筛选，获得优良菌株。

其流程如下：
出发菌株
↓原种特性考察
斜面培养→或液体培养
↓↓
单孢子悬液菌悬液
↓↓
诱变处理←
↓
稀释涂布
↓观察菌落形态，选取功能
菌株
挑取单菌落接斜面或平皿
↓对照试验
保藏菌种（沙土、冻干、砖坯胶、
琼脂斜面等）
↓
传种斜面
↓
平皿或摇瓶复筛
↓
选高性能菌株、保藏，并做稳定性试验，安全鉴定
↓
放大试验（可用发酵罐）
↓各项鉴定
投入生产
一些要考虑的问题：
（1）出发菌株的选择。

一般选取已具有某项功能，但需加强的常用生产菌株。

（2）在众多菌株中，选取对诱变剂敏感性强、变异幅度大的菌株。

在不了解出发菌株敏感性的条件下，同时采用多个出发菌株以提高工作效率。

（3）诱变用的菌悬液应是生理状态一致的单细胞或单孢子的悬液，处理前尽可能使细胞达到同步生长状态。

（4）诱变剂及剂量的选择：
不同微生物对各诱变剂的敏感性不一样，不断变换诱变剂比使用单一诱变剂效果好，几种诱变剂复合处理比用一种诱变剂好。

诱变剂剂量的选择依类型、出发菌株及其生理状态不同而不同。

（5）诱变剂都是致癌物，操作时应小心。

3.2.3平皿快速检测的一些方法
（1）耐酸菌株的筛选
耐酸菌株的筛选可采用“梯度平板法”（具体操作见相关书籍），选
择醋酸为抗性物，将出发菌株经诱变后，稀释成一定的倍数，涂布
于梯度平板上，选取抗性菌株，其后要反复训化，多次筛选。

（2）耐热菌株的筛选
可采用“一次性筛选法”
（3）耐药菌株可采用“梯度平板法”或“纸片扩散法”
（4）产生抗菌素菌株的筛选
采用“抑菌圈法”以摇瓶试验复筛和验证，指示菌（或叫工具菌）
可用畜禽致病菌。

（5）产酶菌株的筛选
淀粉酶、蛋白酶的产生能力可用“透明圈法”，淀粉、酪素作指示。

（6）产酸能力
采用“透明圈法”，用CaCO3做指示剂
（7）产氨基酸或维生素的菌株可用“生长圈法”
对于初步筛选的菌株要进行多次复筛，复筛后的菌株，还要经过如
下程序方可投入生产使用：
①摇瓶或小型罐试验，检测其产物的生成量，做工艺上的研究。

②鉴定。

主要是安全性。

③稳定性试验
3.3菌种的管理
用于益生素的生产皆要符合国家的有关规定。

生产者要清楚菌种的来源、形态及生理生化特性。

确定使用菌种一般应进行鉴定，鉴定内容主要包括形态、培养特性、生化反应观察、毒性试验、血清学检查、代谢产物等等。

使用中的菌种应注意传代次数，对于传代次数多的菌株最好重新鉴定。

培菌人员在日常操作中，应密切注意菌株的变化（如菌落形状、大小、颜色、气味等），发现异常情况应对菌株重新鉴定，以避免变异菌株在生产中使用。

培菌室的菌种应建立档案，以便于了解控制菌种的使用状况。

菌种的保藏、使用、检测等环节都应有专门记录。

3.4菌种的退化与保藏
3.4.1菌种的退化
菌种的退化通常是指微生物一定时间的接种、传代、培养或保藏后，它的
一个或多个生理性状和形态特征逐渐减退或丧失，可以表现为生长能力的减弱、代谢产物的下降或更改等。

益生素生产用菌的退化，主要指菌种各项有益功能的降低，在生产过程中判断其退化主要检查：菌体繁殖能力、芽孢形成能力、代谢产物的变化（包括发酵液的抑菌性能）等。

例如，某个菌种原来在某特定培养基及培养条件下（控制参数、周期等），其发酵液含菌数为20×108个/ml，芽孢率80%，菌种保藏一段时间后，在与过去相同的培养基及培养条件下，其发酵液含菌数降为10×108个/ml，芽孢形成率降为50%，则我们可以说它已经退化。

当我们改变培养基和培养条件，基发酵结果又达到原来的水平，我们也不能说它没退化，只能说它有另一个更好的培养工艺条件。

微生物的变异是绝对的，使用和保藏中，菌种某些生理性状的变化是不可避免的，但退化一般来说是针对某一项或几项有益功能而言。

有些微生物的遗传特征是稳定的，有些是易变异的，在生产实践中应注意观察如下现象：
（1）相同培养条件下的所测发酵结果，如菌数、芽孢率、PH等。

（2）斜面或平皿上的单菌落形态，如菌落形状、颜色等。

（3）菌体细胞的镜检形态。

（4）发酵液、发酵产物的气味、颜色、某些醪液物理特征、泡沫等。

即使上述某项发生了变化，我们并不能判断为其有益功能的退化。

但当发生某项变化时，应注意对有益功能的测定，看其是否发生退化现
象。

3.4.2菌种退化的预防措施
菌种退化的原因是有关基因的负突变。

由于自发突变的频率是较低的，因此一般情况下菌种短期快速降低生产性能也是很不容易的，但就一个经常处于旺盛生长状态的细胞而言，发生突变的机率大大高于休眠状态的细胞。

在一定条件下，群体多次繁殖，可使退化细胞数量易逐渐占优势，于是体现出退化性状。

因此连续接种、传代是菌种退化的一个原因；另外，培养条件、保藏条件、
菌种本身的遗传背景等对菌种退化有较大影响。

防止菌种退化可采取下列措施：
（1）妥善的保藏方法
将菌种保藏在低温、干燥、真空的环境中，可降低菌种的突变率。

（2）减少传代次数
生产菌种每移植一代，最好多接种一些斜面，以供一段时间生产所需，
这样移植次数就可减少。

（3）定期分离纯化
菌种保藏一段时间后，进行单细胞分离筛选，保藏未退化菌落，这是防
止退化的最有效措施。

3.4.3菌种的保藏方法
菌种保藏的目的：保持菌种的优良性状，防止菌种退化、死亡或污染杂菌。

菌种保藏都是依据微生物的特点，人为创造一些条件。

这些条件主要是：低温、干燥、缺氧等。

菌种保藏一般有如下方法：
（1）定期移植保藏法（传代培养保藏法）
将菌种接于培养基上，置于最适条件下培养，待得到健壮菌体后，放4℃，
湿度小于70%的条件下保藏。

该法包括斜面培养、液体培养、穿刺培
养等。

益生素用的乳酸菌、芽孢菌、酵母菌，在日常生产中都可用此法。

（2）液体石蜡保藏法
此法是用液体石蜡浇在斜面上以减少氧气供给，防止水份蒸发，抑制细
胞代谢，达到延长保藏时间的目的。

芽孢菌、酵母菌、乳酸菌可用此法。

（3）砂土保藏法和硅胶保藏法
此法适用于对芽孢菌、霉菌孢子等进行保藏。

（4）冷冻真空干燥保藏法
此法具有低温、真空、干燥三种保藏条件，具有变异少、保藏时间长、运输方便等优点。

适用于大部分细菌、酵母菌、霉菌、放线菌和病毒的保藏。

但不适用于担子菌、嗜热菌、疫霉菌等少数微生物，此法保藏一般在5年以上。

（5）液氮超低温保藏法
这种超低温保藏的原理是：生物在-130℃的低温下，代谢活动暂时停止而生命延续，并不发生变异。

此法适合各种微生物。

3.4.4生产菌种的制备
益生素的生产用菌有许多种，而每一种菌种都有适合它生长及保持原有特征的最适培养条件。

严格意义上说，生产上，任一菌种其培养条件应是不同的。

本节不对某种菌的制备流程进行叙述，仅对菌种制备过程需注意的问题进行讨论。

对于工业生产来说，生产用菌种的制备是非常重要的，菌种的质量直接影响发酵的结果，菌种的质量与培养过程及日常管理紧密相关。

（1）种子的培养基。

生产者要对制种用培养基原料严格要求，对于商品蛋白胨、琼脂等由于生产厂家不同、加工工艺不同、所有原料的不同，因而在质量上、使用效果上可能会有较大的不同。

生产者应根据研究或选定某种品牌的产品，在生产过程中不轻易改动，以免影响菌种的稳定性。

配制培养基时，不能忽视对水质的要求。

为避免水质的影响，有的用蒸馏水配制，并添加某些无机元素；有的用硬度和PH值来控制水质。

为避免琼脂对培养基的影响，可用清水浸泡过夜处理，尽可能除去其中的可溶性杂质。

有些菌种培养基质量对其生产性能影响是非常大的，请切记！
（2）培养条件
培养条件，不仅对菌种的生长数量有影响，更重要的是对菌株生产性能的影响。

例如链霉菌生产斜面培养温度高于37℃时，接入发酵罐后出现糖代谢变慢，氨基氮提前回升，发酵活力下降现象。

培养箱内的相对湿度对菌体生长速度和质量也有影响，相对湿度低时，斜面上水分易蒸发而干瘪，上部长不好；相对湿度高时，斜面底部有积水，斜面上部长得好，下部长不好。

关于种子罐扩大
（1）菌龄：是指适合于接种（接入发酵罐）的种子培养时间。

一般以小时显示。

常用菌龄都是以菌体处在生命活力极强的对数生长期的时间确定。

菌龄
取决于菌种的特性、接种量、培养基、培养条件。

（2）种子罐培养基
种子罐培养的目的是增殖菌体数量，工业上其培养基通常与发酵培养基不一致（因为发酵的目的可能是要代谢产物）。

对于益生素而言，往往以活菌体为发酵目的物，所以菌种培养基可能是与发酵培养基是一致的。

对培养基的要求是，在保持菌种的优良性能前提下，满足快速繁殖的条件。

所以其培养基往往是：合成菌体的营养成份充足、浓度适宜快速生长。

（3）种子质量的判断：
①培养过程PH值的变化
②菌体形态在各阶段的变化
③发酵粘度、色泽等
④生长速度
⑤发酵目的物的生成量
当然，仅仅靠上述判断不一定是科学的，但这些判断往往能从一个侧面反应出菌种代谢发生的变化。

4.益生素的发酵
生产益生素首先要获得优良的菌种，然后用适当的方法进行扩大培养和繁殖，且繁殖后的菌体和代谢产物应具有优良的微生态效应。

这个过程有两点值得注意：
（1）要低成本的繁殖大量有微生态效应的的活菌，即繁殖的菌体必须具有原。