海洋细菌BZ-1的鉴定及抗菌特性研究

海洋细菌BZ-1的鉴定及抗菌特性研究
范延辉,王君
(滨州学院生命科学系,山东省黄河三角洲生态环境重点实验室,山东滨州256603)
摘要 [目的]对海洋细菌B Z -1进行分类鉴定,并研究其抗菌特性。

[方法]根据分离菌的培养特性及菌体形态特征、生理生化反应等,对其进行分类鉴定;通过对峙培养和滤纸片法研究其代谢产物的抗真菌活性。

[结果]海洋细菌B Z -1为枯草芽孢杆菌,对植物致病真菌镰刀菌、紫青霉菌、白色念珠菌、葡萄孢菌都有很好的拮抗作用。

[结论]B Z -1抑菌能力强,值得进一步研究和开发。

关键词 海洋细菌;鉴定;拮抗作用
中图分类号 S482.7 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2009)17-07858-02
S tud y on th e Ide n t ific a t ion a n d An t ifun ga l C h a ra c te ris tic s o f BZ -1FAN Y an -h u i e t a l (D epar tm en t o f L ife S cien ces ,B in zh ou U n ive rs ity ,Sh an don g K ey L ab o f E co -en v ironm en ta l S cien ce fo r Y e llow R iv e r D e lta ,B in zh ou ,S h an don g 256603)A b s tra c t [O b je ctive]T h e re sea rcha i m ed to class ify an d iden tifyth e m a r in e bacte r i umB Z -1,an d to stu dy its an tifun g a l ch a racte r istics .[M e th od]T h e s tra in w a s iden tified an d class ified acco rd in g to th e cu ltu re ch a racter is tics ,m o rph o log ica l fea tu res and ph ys io log ica l an d b io ch e m ica l rea ction s o f iso la te s .T h e an tifu n ga l ac tiv ity o f its m e tabo lite s w as stu d ied by u sin g con fron tin g cu ltu re an d filter pape r m e th od .[R e su lt]M a rin e ba cte rium B Z -1w a s c lassified to B ac illu s sub tilis .I t h ad be tte r an tagon istic e ffects on p lan t pa th o gen ic f u n g i Fu sarium sp .,Pen icilliu m purpu rogenu m,M on ili a alb ican and B o try tis c inerea .[C on clu s ion ]B Z -1h ad stron g an tifu n ga l ab ility and it w a s w o r th fu rth e r stu dy an d deve lopm en t .K e y w o rd s M a r in e ba cte ria ;Iden tifica tion;A n tagon is tic e ffect
基金项目 滨州学院青年人才创新工程科研基金(B ZXYQN LG 200826);
滨州学院博士基金(2008Y03)。

作者简介 范延辉(1980-),男,山东即墨人,硕士,助教,从事微生物
制药研究。

收稿日期 2009-03-20
生物农药与化学农药相比,具有广普、高效、环保等优点[1],随着人们对健康的重视,生物农药将逐步替代化学农药。

海洋蕴藏着极其丰富的微生物资源,特殊的生活环境、生态系统使其代谢产物具有很多新颖的结构和令人惊喜的生物活性[2-5],是一个寻找新型生物药物的宝库。

笔者近期从山东滨州贝壳堤岛分离到了5株能产生活性物质的微生物,并对其中的B Z-1菌株进行了比较系统的研究。

1 材料与方法1.1 菌株来源
海洋细菌B Z -1分离自山东滨州贝壳堤岛,
保藏于滨州学院生命科学系;病原菌尖刀镰刀菌、紫青霉菌、白色念珠菌、葡萄孢菌为山东省黄河三角洲生态环境重点实验室保藏。

1.2 培养基 ①ZoB e ll 培养基:蛋白胨5g ,酵母膏1g ,磷酸铁0.1g ,陈海水1000m l ,pH 值7.6～7.8。

②抑菌活性培养基:葡萄糖4%,蛋白胨1%,pH 值5.6。

③发酵培养基:葡萄糖1%,玉米面1%,豆饼粉0.16%,K 2H PO 40.05%,蛋白胨0.1%,pH 自然。

1.3 菌种的鉴定
1.3.1 形态特征。

于营养琼脂培养基上30℃条件下,培养2d ,取菌体染色后,置光学显微镜下观察菌体形态。

1.3.2 培养特征。

在营养琼脂培养基上在30℃的条件下,培养2～3d 后观察菌落形状及颜色。

1.3.3 生理生化特征。

参照《常见细菌系统鉴定手册》[6]
与
第8版《伯杰细菌鉴定手册》[7]中的方法进行。

1.3.4 16S rDN A 序列分析。

菌种接种于LB 液体培养基,120r/m in ,37℃振荡培养10h ,离心收集菌体,悬浮后加入溶菌酶和SD S 破壁,采用酚-氯仿法提取基因组DN A ,用正相引物27F(5′-GAGAG TT TGA TC C TGGC TCAG -3′)和反向引物1541R (5′-AAGGAGG TGA TC CAGC C -3′),对16S rRN A 基因进行PCR
扩增,扩增的产物由北京三博公司进行测序。

PC R 条件为:94℃,10m in ;94℃,45s ;55℃,45s ;72℃,90s ;30个循环;72℃,10m in 。

4℃保存。

1.4 菌株的抑菌试验
取一环新鲜培养的B Z-1斜面种子,
接入装有25m l 发酵培养基的250m l 三角瓶中,于30℃120r/m in 振荡培养20h 。

取出后用0.1m o l/L 的H C l 调节pH 值至4.0～5.0,3500r/m in 离心8m in ,弃去沉淀后用管碟法测定对真菌的抑制作用。

2 结果与分析
2.1 BZ -1形态特征与培养特征 海洋细菌B Z -1菌株在培养基上生长的幼培养菌落为透明状,直径2～4m m,表面湿润光滑,边缘不规则;老培养菌落变为肉色或略棕色,不透明,菌落不扩散。

菌体细胞为长杆状,周生鞭毛(图1);芽孢中生
,不膨大。

图1 B Z -1菌体电镜照片(23000×)
F ig.1 E le c tro n ic m ic ro s c o p ic p h o to g ra ph o f s tra in BZ -1(23000×)
2.2 BZ -1生理生化特性 B Z -1的生理生化特性结果如表1所示,由表1可知,B Z -1接触酶阳性,兼性厌氧,水解淀粉,不利用柠檬酸盐。

B Z -1的生理生化特性、形态特征、培养特征与芽孢杆菌属的枯草芽孢杆菌比较相似。

2.3 16S r DNA 序列分析 海洋菌株B Z -1的16S rDN A 基因序列长度为1543bp(图2),在G eneB ank 中的登陆号为
安徽农业科学,J ou rn a l o f A n h u i A g r i .S c i .2009,37(17):7858-7859 责任编辑 张彩丽 责任校对 况玲玲
DQ 309593,B LA S T 程序比较分析发现它同B acillus sub tilis (AB 110598)相似性为99%。

根据菌株形态特征、培养特征、生理生化特征及16S rDN A 序列分析结果,B Z -1确定为枯草芽孢杆菌(Bacill us sub tilis)。

表1 海洋细菌BZ -1的生理生化特性
T a b le 1 Ph y s io lo g ic a l a n d b io c h em ic a l c h a ra c te r is t ic s o f m a r in e b a c te r ia
项目
Item s
结果R esu lts 项目Item s
结果R e su
lts 硝酸盐还原+碳源利用
半乳糖+接触酶+果糖+厌氧生长+甘露糖-淀粉水解+鼠李糖-明胶液化
-棉子糖-柠檬酸盐利用-乳糖
-生长试验3%N aC l
+阿拉伯糖-5%N aC l +木糖-7%N aC l +肌醇+0.1%酚-甘露醇+0.01%N aN 3-乙酸钠+溶菌酶
-丙二酸钠
+
注:+:G row th ;-:N o g row th. N o te :+,G row th ;-,N
og row th.
图2 B Z -1菌株16S rD NA 全序列F ig.2 16S rD NA s e qu e n c e o f s tra in B Z -1
2.4 BZ -1的抗真菌活性 试验表明B Z-1对使大豆连作产生障碍的紫青霉、引起根腐的镰刀霉、引起庆霉病的葡萄孢
菌、引起稻瘟病的稻瘟霉及白念珠菌都有抑制作用。

其中,B Z -1对镰刀菌的抑制效果见图3。

图3 BZ -1对镰刀菌的抑制作用
F ig.3 T h e in h ib it io n o f BZ -1on Fu sari um so lan i
3 结论与讨论
我国海域辽阔,蕴藏着丰富的微生物资源。

我国科学家们已从海洋微生物中分离到了多种具有抗肿瘤、抗真菌活性的化合物。

该研究通过系统的细菌学鉴定和16S rDN A 序列分析,将海洋细菌B Z-1确定为枯草芽孢杆菌(B acillus sub-tilis)。

初步研究结果表明,B Z -1产生的活性物质对致病真菌镰刀菌、紫青霉菌、白色念珠菌、葡萄孢菌都有很好的拮抗作用,有潜在的开发应用研究价值。

对于其活性物质的性质、结构等问题正在研究中,将另行报道。

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