七个贵州地方猪种RYR1基因突变的分布_朱锋钊

七个贵州地方猪种RYR1基因突变的分布
朱锋钊,杨春苗,樊翠华,张晓霞,王嘉福,冉雪琴*
(贵州大学动物科学学院,贵州贵阳550025)
摘要:兰尼定受体1(Ryanod i ne R eceptor1,RYR1)基因中的单个氨基酸(R615C)是导致猪应激综合征、影响肉质的重要原因。

采用RFLP方法,以大白猪、二个杂交猪群(杜洛克@长白猪@大白猪和长白猪@大白猪)为对照,研究了糯谷猪、萝卜猪、柯乐猪、宗地花猪、香猪、关岭猪和黔南黑猪7个贵州地方猪种RYR1基因突变的分布类型。

结果表明,从柯乐猪中检测到一例杂合基因型RYR1Nn,杂合基因型的发生频率为2108%,其余6个贵州地方猪种糯谷猪、萝卜猪、宗地花猪、香猪、关岭猪和黔南黑猪均为正常的基因型RYR1NN,对照组中,外三元、外二元杂交猪和大白猪中均检测到RYR1Nn基因型,杂合基因型的发生频率分别为11111%、12112%和5177%,说明贵州地方猪种中RYR1基因的突变频率低于商品猪,但也存在一定的比例,应加强对地方猪种的利用和保护。

关键词:贵州地方猪种;RYR1;RFLP;猪应激综合征
中图分类号:S82713文献标识码:B文章编号:0529-5130(2009)04-0052-04
猪应激综合征(Po rcine S tress Syndro m e,PSS)是猪在运输、转栏、高温、疫苗注射、配种等应激条
收稿日期:2008-10-22
基金项目:贵州省/十一五0农业重大专项科技攻关计划项目(黔科合NZ字2005-3002);贵州省优秀青年科技人才培养计划(黔科合人字2005-0506号);贵州大学研究生创新基金(省研农2007001)。

作者简介:朱锋钊(1983-),男,硕士。

*通讯作者。

件下发生的一种恶性高热综合征(M alignant H yper-ther m ia Syndr o m e,MH S)。

其主要原因是兰尼定受体1(Rynod i n e Receptor1,RYR1)基因发生了突变。

RYR1基因又称骨骼肌C a2+释放通道基因(Ca lcium Release Channe,l CRC),位于6号染色体的6p11~ q21区,mRNA为1513kb,目前尚未获得其全基因。

人RYR1基因含有106个外显子,跨跃160kb,编码1513kb的mRNA,是迄今研究的最复杂的基因之一[1]。

以野生基因型(RYR1NN)存在时,表现为抗
3讨论
夏季高温高湿的环境很容易引起鸡的热应激,在热应激状态下,为了降低机体的温度,鸡需要通过大量饮水和排便来进行体散热,从而造成体内钾离子和钠离子大量丢失,导致内分泌机能发生紊乱。

通过低温水的饮用可缓解热应激,减少粪便的含水量,从而减少了钾离子和钠离子损失,减少鸡的呼吸次数,维持血液中二氧化碳浓度,改善了鸡体内环境,保持鸡只健康,从而保证鸡的生产性能。

高温环境下,产蛋鸡呼吸频率加快,引起血液中二氧化碳浓度下降而导致酸碱平衡失调。

血液中p H 值升高,引起呼吸性碱中毒,减弱蛋壳在子宫部的形成能力。

同时,产蛋鸡的甲状腺机能活动下降,从而导致机体代谢率降低,产热减少。

高温下产蛋鸡体内甲状腺分泌减少,可引起产蛋量和蛋壳质量下降。

本试验表明,饮用低温水后,可显著改善蛋壳质量。

本试验的试验结果显示,饮用低温水可以提高鸡的生产性能,改善蛋品质,与张心如等人建议夏季饮用清凉低温冷水的观点相一致,可能是由于低温水可以降低鸡的体温,缓解的高热环境给鸡到来的应激,调节机体内环境,并提高蛋品质,因此建议饮用低温水。

4结论
在炎热的夏季,给鸡饮用低温水,可提高产蛋率,改善蛋品质,对稀粪现象有所缓解。

试验组Ñ蛋黄、蛋重较其他两组高;试验组Ò哈氏单位最高;试验组Ó产蛋率最高,蛋壳质量显著提高。

从各方面综合考虑,试验组Ó最佳。

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应激猪;纯合的双拷贝突变(RYR1nn)则表现为应激敏感猪,受到应激刺激后,表现出体温升高达42 ~45e,呼吸困难、发绀、肌肉僵直,常突然死亡,宰后肉质下降,出现灰白色的白肌肉(pa le,sof,t ex-udati v e,PSE)[2-4]。

给世界各国的养猪业造成重大经济损失。

美国每年因PSE肉的经济损失达213~312亿美元,丹麦商品猪中产生的劣质肉约占10%~ 15%,全球每年因PSE肉损失数十亿美元[5]。

贵州拥有多种地方畜禽品种,柯乐猪、糯谷猪和萝卜猪等,具有肉质优良、耐粗饲、抗逆性好等优点[6-7]。

但国内商品猪的规模化养殖,有可能对地方猪种造成RYR1nn基因型的污染,因此本文研究糯谷猪、萝卜猪、柯乐猪、宗地花猪、香猪、关岭猪和黔南黑猪七个贵州地方猪种的RYR1基因分布类型,以期为贵州地方猪种的选育和种质资源的保护提供理论依据。

1材料和方法
111材料
贵州糯谷猪、萝卜猪、柯乐猪、宗地花猪、香猪、关岭猪和黔南黑猪血液样品分别采自贵州省毕节纳雍县、铜仁江口县、毕节纳雍县、安顺紫云县、黔东南从江县、安顺关岭县、黔南三都县等地的保种场,外三元杂交猪(杜洛克@长白猪@大白猪)和外二元杂交猪(长白猪@大白猪)血液样品采自贵州省贵州大学种猪场;大白猪样品采自贵州大学种猪场。

共采集血液样品375份,其中糯谷猪52份、萝卜猪20份、柯乐猪48份、宗地花猪20份、香猪36份、关岭猪19份、黔南黑猪20份、外三元杂交猪45份、外二元杂交猪33份、大白猪52份。

采血方法:耳缘静脉采血,每头猪采10mL,肝素钠抗凝,于-80e冻存。

112主要试剂
血液DNA提取盒、胶回收试剂盒购自Om ega公司;质粒提取试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司;p MD18-T V ector试剂盒、Eco RÑ、H indÓ、H haI限制性内切酶及T4DNA连接酶购自宝生物工程(大连)有限公司;DL2000DNA m arker、Ex Taq DNA聚合酶购自天根生化科技(北京)有限公司;大肠杆菌DH5A为本实验室保存菌种。

引物合成及碱基序列测定均由上海鼎安生物工程有限公司完成。

113PCR扩增
扩增RYR1基因相应的DNA片段。

使用血液DNA提取盒提取血液基因组DNA,溶于适量TE,4e保存。

引物参照文献[8]序列为:上游引物P1: 5c-TCCAGTTT GCCACAGGTCCTACCA-3c,下游引物P2:5c-ATTCACCGGAGTGGAGTCTC TGAG-3c,预扩增片段的长度为659bp。

PC R反应体系:DNA模板约100ng,10@PCR 缓冲液2L L,25mmo l/L M gC l22L L,215mm o l/L d NTPs116L L,10pmm o l/L L引物各014L L,Taq酶1U,加水至总体积20L L。

扩增条件为:94e预变性8m i n,94e变性45s,57e~61e退火40s, 72e延伸1m i n,30个循环,最后72e延伸5m i n, 4e保存。

PCR扩增产物经115%琼脂糖凝胶电泳检测。

114RFLP分析
酶切反应体系:总体积20L L,其中PCR产物10L L,10@Buffer M2L L,H haÑ限制性内切酶为1U,加水至20L L,37e消化3h。

酶切产物以2%琼脂糖凝胶电泳检测。

115扩增片段的克隆与测序
经RFLP分析检测到的所有带突变型,以及部分野生型样品的PCR扩增片段经琼脂糖凝胶电泳分离后回收,与p MD18-T载体16e连接过夜,转化感受态大肠杆菌TG1,菌落PC R及酶切鉴定阳性的质粒测定核苷酸序列。

2结果
211RYR1基因的扩增及RFLP分析
以猪全血基因组DNA为模板采用一对特异性引物P1和P2进行PCR扩增,获得一条659bp条带,与预期大小相符。

阴性对照以羊全血基因组DNA为模板,未能扩出条带。

扩增的659bp DNA片段经限制性内切酶H ha I 消化,获得2种带型,一种为493bp+166bp两条带,为野生型RYR1NN;另一种为659bp+493bp+ 166bp3条带,为杂合型RYR1N n(图1),阴性对照不能被切割,所有样品都没有到纯合基因型RYR1nn。

将RFLP分析获得的所有杂合基因型RYR1Nn和部分纯合基因型RYR1NN扩增片段经琼脂糖凝胶电泳分离纯化,克隆后测序,证实扩增片段位于RYR1全基因的起始码18126~18784bp处,跨越RYR1基因的第17内含子和第17外显子。

基因编码区第1843位碱基发生变化:RYR1NN基因型的碱基均为C;RYR1N n基因型的碱基为C或T, C/T突变导致RYR1基因编码区615位氨基酸由精氨酸(A rg)突变为半胱氨酸(Cys)。

M.DL2000DNA m arker;1,2.RYR1DNA片段;3,4,5.杂合型RYR1N n.6,7.野生型RYR Nn
图1猪RYR基因突变的RFLP分析212RYR1基因C1843T突变的基因型频率和基因频率
从245份贵州地方猪种样本和130份对照组猪种样本中检测到两种基因型:野生型RYR1N N和杂合基因型RYR1N n,没有检测到隐性纯合基因型RYR1nn。

所检测的糯谷猪、萝卜猪、宗地花猪、香猪、关岭猪和黔南黑猪6种贵州地方猪种均为野生型RYR1NN,自柯乐猪中检测到一个杂合基因型RYR1N n,杂合基因型比例为2108%。

对照组猪种共检测到12个杂合基因型,占9123%,明显高于贵州地方猪种,相应地,对照组中商品猪的n等位基因频率明显高于贵州地方猪种(表1)。

表1贵州地方猪种和商品猪RYR1基因C1843T突变的基因频率和基因型频率
组别品种(系)样本数杂合型数
等位基因频率
N%n%
基因型频率
NN%Nn%nn%
外三元杂交猪45594144515688189111110对照组外二元杂交猪33493194610687188121120大白猪5239711221889412351770
糯谷猪520100010000
萝卜猪200100010000贵州柯乐猪4819819611049719221080地方宗地花猪200100010000猪种组香猪360100010000关岭猪190100010000
黔南黑猪200100010000
3讨论
对七种贵州地方猪种糯谷猪、萝卜猪、柯乐猪、宗地花猪、香猪、关岭猪和黔南黑猪的RYR1基因多态性进行了检测,结果表明,仅从柯乐猪中检测到1例杂合基因型(RYR1Nn),占糯谷猪群体的2108% (n=48),n等位基因的频率为1104%;其他6种贵州地方猪种均为RYR1NN基因型,n等位基因的频率为0。

对照组中,外三元、外二元和大白猪3个猪群中均检测到RYR1Nn基因型,比例分别为11111%、12112%和5177%,n等位基因的频率分别为5156%、6106%和2188%。

贵州地方猪种的n等位基因频率明显低于对照组(P<0105),与内江猪、二花脸猪、五指山猪和香猪的检测结果相似[9],说明n等位基因在中国地方猪种中的分布较少。

其原因可能与地方猪种的形成有关。

本文研究的七个贵州地方猪品种都是经过长期的自繁自养形成的地方品种,具有良好的抗应激能力。

在近年的研究中,欧洲猪种n等位基因的群体表达率依然较高,25%以上的北美和欧洲育种猪群中存在n等位基因,皮特兰猪和比利时系长白猪达95%以上,波中猪为80%,长白猪为37%,大白猪、杜洛克和汉普夏为22%,约克夏猪为17%[10]。

本文对照组中,无论是纯的大白猪,还是外二元、外三元杂交猪,都存在较高的杂合基因型RYR1N n,为猪PSS 的发生带来了可能性,因此,在引进欧洲猪种时,应当加强对n等位基因的检测。

研究表明,n等位基因的出现与欧洲猪种的高瘦肉率选育直接相关[11]。

杜洛克、大白猪、长白猪等欧洲猪种主要以瘦肉率和生长速度为指标选育形成,
而RYR1基因的n等位基因与高瘦肉率正相关,因此选育的欧洲猪品种的瘦肉率大幅提高,但同时,其中RYR1的n等位基因在群体中的表达率也随之升高[12],如皮特兰猪中可高达95%。

RYR1基因的n 等位基因是隐性基因,其对应的N等位基因为野生型,N等位基因对n等位基因表现为显性遗传,当个体为RYR1NN基因型时表现为抗应激猪,以RYR1nn基因型存在时表现为应激敏感猪。

虽然RYR1N n基因型个体表现为抗应激能力正常,但可将携带的n等位基因传给后代[13]。

将应激敏感猪和抗应激猪RYR1基因的c DNA相比较,应激敏感猪RYR1基因编码区第1843位碱基发生了转换(C/T),使成熟肽615位氨基酸密码子从CGC突变为TGC,编码的氨基酸从精氨酸(A r g)突变为半胱氨酸(Cys),引起RYR1蛋白结构发生了改变,RYR1蛋白不能被正常降解,导致Ca2+通道过度开放或关闭,骨骼肌对应激刺激的敏感性提高,即使是轻微的刺激也会使肌细胞肌浆网终末池中的Ca2+大量释放,肌浆中的C a2+浓度迅速升高(由静息时Ca2+浓度小于5@10-6m ol/L升至5 @10-4mo l/L),引起肌细胞收缩的强度和时间超过正常水平,久而久之,刺激肌细胞的生长(伸长和变粗),因此带有RYR1突变基因的应激敏感猪比正常猪的肌肉发达[14-15]。

然而肌肉的长时间收缩使肌糖原无氧酵解延长,造成肌肉中CO2和乳酸积累, p H值下降(p H<610),引起肌膜变性、崩裂,组织脆弱、致密性下降,细胞内多种酶和电解质渗入血浆,使可溶性蛋白质和结构蛋白质变性,造成肌肉吸附水的能力降低,水分由细胞质渗入细胞间,导致心律和呼吸频率加快,严重时导致动物猝死[16]。

本文的研究结果表明贵州地方猪种中应激敏感的RYR1基因n等位基因频率明显低于欧洲猪种,是贵州地方猪种抗应激能力的主要原因,同时贵州地方猪种中也发现了突变基因型的存在,应当加强对贵州地方猪种的保护和利用。

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