PPARs激动剂体外筛选模型的建立及其在泽泻活性成分筛选中的应用

PPARs激动剂体外筛选模型的建立及其在泽泻活性成分筛选中的应
用
利用酵母GAL4 BD-UAS反式激活分析（transactivation assay）系统在哺乳动物细胞中建立以过氧化物酶体增殖物受体的配体结合结构域（PPARs-LBD，包括PPARα，PPARβ和PPARγ）为靶点的体外筛选模型，并应用该模型对泽泻化学成分进行筛选，研究泽泻14种化学成分对PPARs的激活作用。

首先构建GAL4 BD-PPARsLBD融合表达质粒pBind-PPARs-LBD，采用Lipofectamine将表达质粒pBind-PPARs-LBD与含有UAS：luciferase报告质粒pGL4.35共转染293T 细胞。

以PPARs的激动剂（PPARα：非诺贝特；PPARβ：L165041；PPARγ：罗格列酮）为阳性对照，通过测定萤火虫荧光素酶活性来验证系统是否构建成功，并用该系统来考察泽泻中14种化学成分对PPARs靶点激活的影响。

PPARs的阳性激动剂结果显示系统构建成功，用该系统分析泽泻化学成分结果显示泽泻单体化合物5，6，7，8，13，14对PPARα有激活作用，化合物5，7对PPARβ有激活作用，而化合物6，7，8，12对PPARγ有激活作用，其中化合物12对PPARγ有显著激活能力。

该研究在哺乳动物293T细胞中成功构建以PPARα/β/γ配体结合结构域为靶点的体外筛选细胞模型，并成功应用于泽泻PPARα/β/γ的天然激动剂的筛选。

标签：过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARs）；激动剂；泽泻；三萜成分
[Abstract]Peroxisome proliferators activated receptors （PPARs）are closely related to human chronic disease，such as diabetes mellitus and the other metabolic diseases. In this study，a cell-based PPARs （PPARα/β/γ）model was developed for the screening of PPARs agonists from Alismatis Rhizoma （AR）. Firstly，293T cells were transfected with the reconstructed plasmid pBind-PPAR （α，β，orγ）-LBD and reporter gene pGL4.35，and the known PPARs agonists were used as the positive control （fenofibrate for PPARα，L165041 for PPARβ，and rosiglitazone for PPARγ）. The ability of activation for PPARs was evaluated by analyzing the expression value of luciferase. Afterward，the 14 pure triterpenoids isolate from AR were analyzed on the developed PPARα，PPARβ and
PPARγ screening assay method. The results showed that the compounds 5，6，7，8，13 and 14 from AR have the abi lity of activation for PPARα. The compounds 5 and 7 from AR have the ability of activation for PPARβ. The compounds 6，7，8 and 12 from RA have the ability of activation for PPARγ.In this study，the compound 12 from AR were found to display significant act ivation on PPARγ for the first time. AR triterpenoids extracts had the ability of activation for PPARα，PPARβ and PPARγ. The results suggested that triterpenoids extracts from AR were PPARα，PPARβ and PPARγ agonists. The results will help to provide refere nce for clinical application of AR，and establish a model for PPARs on 293T cell，which can be
used to screen and evaluate PPARs natural agonists.
[Key words]peroxisome proliferator-activated receptors；agonist；Alismatis Rhizoma；active triterpenoids ingredients
doi：10.4268/cjcmm20162121
过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARs）是核激素受体超家族中的配体激活转录因子，参与许多與慢性疾病密切相关的临床生理和病理过程，成为代谢疾病（2型糖尿病、高血脂、心血管疾病等）治疗的重要靶点[1]。

其作用机制是PPAR 与类维甲酸受体（RXR）形成异源二聚体，再与靶基因启动子上的PPRE序列结合，之后通过配体的激活诱导辅阻遏物蛋白的分离和辅激活物的募集，形成PPAR 活化复合物，导致糖脂代谢、脂质平衡、脂肪细胞分化的基因表达发生改变[2]。

PPARs具有多种生物学效应，调控着大量涉及调节糖脂中间代谢、内稳态、脂肪细胞分化、胰岛素敏感、免疫应答、细胞增长和变异的基因表达，是调整糖脂代谢综合征有效的治疗方法，如降脂药贝特类药物及降糖药TZDs类药物[3]，但是这些合成药物如TZDs常常会导致病患体增重、水肿，并增加罹患心肌梗塞的风险，同时还会产生肝毒性；而贝特类降脂药会增加患胆结石的风险，引起肌肉衰竭等[4]，从中药中寻找活性更佳，副作用更小的PPARs激动剂已成为当今制药研究的热点和PPARs药物研发的主要研究趋势[5]。

泽泻Alisma orientale（Sam.）Juzep作为一味传统中药，表现出多方面的药理学活性，包括利尿、神经保护、降血脂、抗动脉粥样硬化、降血糖、抗炎、抗肿瘤和抗氧化活性[6]，成为许多传统中医药配方不可或缺的部分。

已有文献表明泽泻提取物是PPARs的多重激动剂[7]，但是具体的活性成分尚未阐明，因此，本研究建立PPARs激动剂体外筛选模型并应用泽泻PPARs相关活性成分的筛选，为泽泻降脂降糖作用机制提供参考，也为具有潜在PPARs活性的天然药物活性成分筛选提供一种高通量模型。

1 材料
BCD-248冰箱（中国Haier公司）；SW-CJ-1FD型超净工作台（苏净安泰空气技术有限公司）；Milli-Q超纯水仪（美国Millipore公司）；HERACELL 150i 型CO2恒温培养箱（美国Thermo公司）；DK-8D电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；CPA225D 1/10万分析天平（德国Sartorius公司）；台式pH 计（美国METTLER TOLEDO公司）；TDL-50B台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；低温高速台式离心机，移液枪（德国Eppendorf公司）；RNA逆转录仪，ABi 7900 Quantitative real-time PCR仪（美国ABi公司）；小型垂直电泳槽，小型转印槽，基础电泳仪电源及凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）；Leica DMIL LED 倒置显微镜（德国徕卡仪器公司）；FLUO STAR Omega多功能荧光酶标仪（德国BMG LABTECH公司）；GloMax 20/20单管光度计（美国Promega公司）；6孔培养板，24孔板，96孔板，培养瓶（美国Corning Costar公司）。

人胚胎肾细胞株293T，人宫颈癌细胞株HeLa和人肝癌细胞株HuH7（中国科学院上海细胞库，由本实验室保存）；pBind，pGL4.35质粒（厦门欣基生物科
技有限公司）；大肠杆菌DH5α菌株（由本实验室保存）。

DMEM培养基，胎牛血清，双抗（PS）青链霉素混合液，胰蛋白酶，PBS 缓冲液，磷酸盐缓冲液（美国Hyclone公司）；TRizol试剂，DEPC-H2O，Lipofectamine LTX and Plus Reagent 15338-100（美国Invotrogen公司）；DNA聚合酶，限制性内切酶，DNA连接酶（大连宝生物工程有限公司）；cDNA合成试剂盒ReverTra Ace qPCR RT Kit，荧光定量PCR试剂盒SYBR Premix ExTaqTM Ⅱ，RT-PCR试剂盒Accu Power 2× Greenstarq PCR Master Mix，DNA纯化试剂盒QIA quick PCR purification Kit（日本Takara公司）；质粒提取试剂盒，琼脂糖，双荧光素酶检测试剂盒Dual-Luciferase Reporter Assay System E1910（美國Promega公司）；AMP（美国Amresco公司）；DMSO，MTT（美国Sigma公司）；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒，超敏ECL化学发光试剂盒，Western及IP细胞裂解液，彩色预染蛋白质相对分子质量标准，TBSSDS-PAGE电泳液，Western转膜液，Western封闭液，Western一抗稀释液，Western二抗稀释液（碧云天）；鼠抗β-actin，兔抗多克隆PPARα（H-98）抗体sc-9000，兔抗多克隆PPARβ（H-74）抗体sc-7197，兔抗多克隆PPARγ（H-100）抗体sc-7196（Santa Cruz Biotechnology 公司）；其他化学试剂均为国产分析纯试剂。

泽泻化合物1～14，分别为泽泻醇A（1）、24-乙酰泽泻醇A（2）、泽泻醇B （3）、23-乙酰泽泻醇B（4）、泽泻醇C（5）、23-乙酰泽泻醇C（6）、泽泻醇F （7）、24-乙酰泽泻醇F（8）、泽泻醇G（9）、泽泻醇L（10）、11-去氧泽泻醇B （11）、13，17-环氧-24-乙酰泽泻醇A（12）、16-羰基泽泻醇A（13）、16-羰基-24-乙酰泽泻醇A（14）及泽泻三萜提取物（15）（均由本实验室分离制备[8-11]，其中三萜提取物按照前期研究工艺对泽泻总三萜部位进行富集纯化后所得的部位[12]），化学结构见图1；罗格列酮、非诺贝特及L165041（美国Sigma公司）。

2 方法与结果
2.1 pBind-PPARs-LBD表达质粒的构建及鉴定
本实验选择使用pBind（含有酵母GAL4 DNA结合结构域且带有Flag标签）质粒作为载体[12]，结构见图2。

采用Trizol法提取293T，HeLa和HuH7细胞总混合RNA，利用Premier 5.0软件设计PPARs PCR引物，见表1，通过RT-PCR 从293T，HeLa和HuH7细胞RNA克隆PPARα-LBD cDNA，PPARβ-LBD cDNA 和PPARγ-LBD cDNA序列，PCR反应产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，胶回收目的条带，将载体pBind和目的基因PPARs-LBD PCR产物进行酶切，回收、纯化酶切产物，再将PPARs-LBD连接至pBind Gal-DBD形成新的功能质粒pBind-PPARs-LBD，并转化至DH5α感受态大肠杆菌中，挑取单克隆，菌落PCR 验证后用LB液体培养基扩大培养菌落，按照Promega质粒提取试剂盒操作抽提重组质粒阳性克隆，参考PPARs-LBD和pBind的序列，采用KpnI和XhoI对构建的表达质粒进行双酶切鉴定，pBind-PPARs-LBD鉴定结果见图3，显示的电泳条带位置与核酸相对分子质量标准Marker比较，发现在1 000 bp左右有与目的相对分子质量大小（963 bp）位置相当的条带，酶切产物的另一条特异带在 5 000～7 000 bp，应为载体的一部分，重组质粒经双酶切电泳验证后送厦门欣基生
物科技有限公司进行测序鉴定，测序结果通过NCBI Blast比对，询问序列和目标序列完全匹配，同源性100%，表明表达质粒构建成功，可用于下一步的转染实验和报告基因的检测。

2.2 pGL4.35报告质粒
pGL4.35质粒结构见图2，质粒购买自美国普洛麦格（Promega）公司。

2.3 PPARs表达质粒细胞转染及其表达验证
2.3.1 细胞培养293T细胞在37 ℃，5% CO2，饱和湿度的培养箱中用含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素、100 mg·L-1链霉素的DMEM培养基培养，每3～4 d以0.25%胰蛋白酶进行消化传代。

2.3.2 PPARs质粒转染细胞及其载体表达检测①接种细胞，转染前5～8 h 将293T细胞以每孔细胞密度1×104个/mL接种至6孔板中，每孔2 mL，培养至细胞融合率达70%～90%取出；②将4 μg的pBind-PPARs-LBD质粒和2 μg的pGL4.35报告质粒加至150 μL的无血清DMEM培养基中，并向其中加入6 μL 的PLUSTM Reagent混匀。

PLUSTM Reagent与DNA的比例为1∶1（L∶g）；
③将15 μL的Lipofectamine LTXReagent加至另外150 μL的无血清DMEM培养基中，轻轻混匀，Lipofectamine LTXReagent与DNA的比例为2.5∶1（L∶g）；
④将②DNA悬液和③Lipofectamine LTXReagent悬液混合，总体积300 μL，轻轻混匀，室温静置5 min；⑤将④DNA和Lipofectamine LTXReagent混合液加至6孔板中，前后左右晃动孔板混匀，置于培养箱中培养，由于是带血清转染，中途无需对细胞进行换液；⑥转染细胞24 h后，0.25%胰酶消化细胞，然后铺24孔板，6孔板一个孔的细胞铺一个24孔板，每孔500 μL培养基，此时同时加入药物，前后左右晃动孔板混匀，置于培养箱中培养，继续培养24 h。

通过Realtime PCR和Western blot法检测细胞PPARs-LBD的表达。

Realtime PCR检测PPARs-LBD mRNA的表达结果见图4，与空白对照相比，重组质粒pBind-PPARs-LBD转染的293T细胞PPARs-LBD具有明显的表达。

Western blot 结果见图5，表明获得目的条带，含有重组质粒pBind-PPARs-LBD和报告基因pGL4.35的293T细胞PPARs-LBD蛋白有明显的表达，说明构建的PPARs表达质粒可以在细胞中正常表达，可以用于进一步的表达筛选检测。

2.4 泽泻PPARs活性成分筛选
2.4.1 药物配制泽泻单体化合物1～14、泽泻三萜提取物（15）和阳性药物（非诺贝特、L165041和罗格列酮）分别以DMSO为溶剂配制成一定浓度的母液，保存于-20 ℃的冰箱中，使用前用细胞培养液稀释成需要的浓度[泽泻化合物1～14质量浓度均为10 mg·L-1，泽泻三萜提取物（15）质量浓度为50 mg·L-1，阳性药物质量浓度均为0.5 mg·L-1]，保證96孔板中每孔DMSO的含量小于0.1%。

2.4.2 MTT法评价给药浓度安全性以每孔细胞密度1×104个/mL接种293T 细胞到96孔板，待细胞融合率达70%～90%时，分别加入用培养基配制的泽泻
单体化合物（1～14）、泽泻三萜提取物（15）及阳性药物（0.5 mg·L-1）干预24 h（加入的药物均控制每孔DMSO含量<0.1%），避光条件下，每孔加入0.5 g·mL-1MTT的PBS溶液，使MTT终浓度达0.5 g·L-1，37 ℃孵育4 h，弃去培养液，每孔加入100 μL DMSO，低速振荡10 min，在酶标仪490 nm波长处测定其吸光度，计算细胞活力，结果表明受试药物在实验相应浓度下对细胞增殖无影响。

2.4.3 加药转染细胞24 h后，0.25%胰酶消化细胞，然后铺24孔板，6孔板一个孔的细胞铺一个24孔板，每孔500 μL培养基，泽泻化合物1～14加药质量浓度均为10 mg·L-1，泽泻三萜提取物（15）加药质量浓度为50 mg·L-1，阳性药物加药质量浓度均为0.5 mg·L-1，加药后前后左右晃动孔板混匀，置于培养箱中培养，继续培养24 h。

2.4.4 荧光素酶活性的检测细胞培养24 h后，拿出培养箱，弃去培养基，每孔细胞用 1 mL 1×PBS缓冲液洗一遍，吸尽PBS缓冲液，每孔加入100 μL1×passive Lysis buffer，室温摇床晃动裂解15 min，将裂解液转移到1.5 mL EP 管中，12 000 r·min-1，4 ℃离心5 min，使用GloMax 20/20单管光度计测定萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的表达：a.取10 μL裂解液置于Axygen的EP管中，向其中加入10 μL的LARII（Firefly），测定萤火虫荧光；b.测定完成后，再向其中加入10 μL 1×Stop &Glo Reagent测定海肾荧光（Renilla）。

记录不同实验组firefly荧光素酶表达量对renilla荧光素酶表达量的比值，然后将各药物处理组的值对阴性对照孔的值进行归一化处理，拿得到的新的比值进行作图统计。

泽泻受试药物5，6，7，8，13，14，15能激活PPARα，受试药物5，7，15能激活PPARβ，受试药物6，7，8，12，15能激活PPARγ，其中化合物12对PPARγ激活能力最显著，见图6。

3 讨论
PPAR筛选模型的构建已有文献[7，13-14]报道，多数文献构建了其中1种或者2种，主要筛选集中于PPARγ和PPARα[5]，并且用于评价降脂降糖候选活性成分。

近年来，随着PPARβ研究的深入，发现其与糖脂紊乱和心血管疾病也存在密切联系，也是降脂降糖功效靶点之一[15]，因此，在前人研究的基础上，通过将能被PPARα，PPARβ或PPARγ配体激活并诱导荧光素酶基因表达的重组质粒（pBind-PPARα/β/γ-LBD），分别转入293T细胞中，并分别以PPARs特异性或选择性激动剂（非诺贝特，L165041，罗格列酮）作为检验标准，构建相应的模型，研究泽泻中15种活性成分对PPARα/β/γ是否具有激活作用。

同时，本研究PPARs激活作用的检测采用双荧光检测法，pBIND质粒是一种包含了酵母Gal4的DNA结合区（Gal4-DBD）和糖皮质受体配体结合区（GR-LBD）的载体，当其被配体激活时，可诱导包含有Gal4上游激活序列的基因转录表达。

本研究正是利用此机制，在GR-LBD区构建一种带有PPARα/β/γ-LBD的嵌合性质粒，这种质粒是由酵母的反作用子Gal4-DBD（DNA结合区）和PPARα/β/γ-LBD（配体结合区）组成，选择的报告基因则是含有Gal4的特异性相应原件的并带有萤火虫酶素基因（Firefly）的质粒，pGL4.35为pBIND的配套报告基因。

当
PPARα/β/γ-LBD被測试药物激活后，就能诱导报告基因pGL4.35表达并产生荧光酶素，通过测定荧光酶素表达含量的高低，来确定测试药物对PPARs的激活能力。

其中renilla荧光素酶和PPARs-LBD在同一个载体上表达，renilla荧光素酶的表达作为内对照反映目标基因PPARs-LBD的表达，用来排除Firefly荧光素酶表达量高不是因为转染了更多的PPARs-LBD表达质粒造成，因此将各药物处理组的firefly与renilla比值（荧光素酶活性）对阴性对照孔的firefly与renilla比值进行归一化处理，将得到的新的比值进行活性统计[14]。

在本研究中，首先根据重组质粒pBind-PPARs-LBD及报告质粒pGL4.35的鉴定结果对其进行验证，鉴定结果为阳性，则采用该功能质粒和报告基因转染293T细胞。

之后，通过Realtime PCR和Western Blot检测细胞模型PPARs-LBD 的表达，结果表明重组质粒pBind-PPARs-LBD转染的293T细胞PPARs-LBD有明显的表达，确定细胞筛选模型构建成功。

另外，通过MTT实验检测14种泽泻活性成分及3种阳性药物在一定浓度下均没有明显抑制293T细胞的增殖。

最后，通过检测药物处理后细胞筛选模型的荧光素酶活力来测定泽泻中分离制备的化合物对PPARs的激活作用。

泽泻PPARs活性筛选初步结果表明，化合物5，6，7，8，13，14能激活PPARα，构效分析可知激活PPARα的活性成分均具有的C16位的氧化取代，同时C11位羟基取代骨架结构；化合物5，7能激活PPARβ，两者均为无乙酰基取代而具有C16位的氧化取代及同时C11位羟基取代的骨架结构；化合物6，7，8，12能激活PPARγ，其中化合物12对PPARγ激活能力最为显著，可能与其独特的13，17环氧取代有关，并通过进一步配制系列不同质量浓度（1，2.5，5，7.5，10，15 mg·L-1）分别检测其激活PPARγ活力，计算EC50为（6.94±0.84）mg·L-1 [阳性药罗格列酮EC50为（0.32±0.08）mg·L-1]。

同时本实验发现泽泻三萜提取物（15）具有同时激活PPARα，PPARβ和PPARγ的活性，Rau O等[7]研究表明泽泻乙醇提取物具有同时激活PPARα，PPARβ和PPARγ的活性，与泽泻总三萜提取物（15）筛选的结果一致，说明三萜类化合物可能是泽泻PPARs活性的主要药效物质基础。

另外，本研究也发现，当泽泻提取物给药浓度较高时（≥75 mg·L-1）出现PPARs活性较为明显的下降，未能呈现良好的剂量依赖关系，可能与其产生的细胞抑制作用有关。

4 结论
本研究在配受体水平上，成功构建含有PPARs-LBD的功能质粒，将泽泻中分离制备的14种化合物直接与PPARs受体作用，只有当PPARs被激活时，荧光蛋白酶才能有效的表达并被检测，从而研究待测成分是否具有PPARs活性。

采用该研究思路和方法，在细胞水平上成功建立一种以PPARα/β/γ为靶点的体外筛选细胞模型，以阳性药物为对照，从泽泻中的15种受试药物筛选出PPARα，PPARβ或PPARγ的天然激动剂。

[致谢]中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所颜立冲博士对本课题研究中质粒构建、细胞转染等工作提供了协助和指导。

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