微生物发酵法中试生产1,3-丙二醇
合集下载
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
・
现代化工 X>D8;= JE8(AC:F L=DMB<;G
第 "* 卷第 " 期 "%%* 年 " 月
微生物发酵法中试生产 ! ， "# 丙二醇
" " 刘海军! ， ， 张代佳! ， 徐友海! ， ， 孙亚琴! ， 吕继萍" ， 牟
英! ， 修志龙!
（! # 大连理工大学生物科学与工程系， 辽宁 大连 !!$%"& ； 吉林 吉林 !’"%"!） " # 中国石油吉林石化分公司研究院，
(— (， 35 丙二醇； - —菌体浓度； 3 —纯甘油
图3
-) %3 罐纯甘油厌氧批式流加发酵结果
(— (， 35 丙二醇； - —粗甘油
图(
( %3 罐发酵粗甘油厌氧批式流加发酵结果
(— (， 35 丙二醇； - —菌体浓度； 3 —纯甘油
图*
-) %3 罐纯甘油厌氧批式流加发酵结果
从发酵结果可以看出， -) %3 发酵罐试验结果要 差于 ( %3 发 酵 罐 的 试 验 结 果。 在 相 同 的 发 酵 时 间 里， - 次发酵结果的平均 数 据 如 下： (， 35 丙 二 醇 质 量 浓度为 :3 4 7 9 0 /， 得 率 为 *7 4 7 = ， 生 产 效 率 为 ( 4 86
!
!"#
结果与讨论
实验室试验结果 实验室试验在 () / 发酵 罐 中 进 行， 分别考察了
发酵粗甘油和纯甘油为原料的发酵试验。以发酵粗 甘油为原料的发酵试验 共 进 行 了 3) 4 ) " ， 产 物 (， 35 丙二醇最高质量浓度为 67 4 78 9 0 /， 生产效率 为 - 4 :( ・"） ； 以纯甘油为原料的发酵试验共进行了 9（ 0 / *) 4 + "， ;< 值达到 (* 4 )) 以上， (， 35 丙二醇最 高 质 量 浓度为 8( 4 *+ 9 0 /， 生产效率为 - 4 )( 9 （ ・"） 。 0 / !"! -4-4( 中试结果 ( % 规模发酵罐的发酵试验结果
(— (， 35 丙二醇； - —菌体浓度； 3 —纯甘油
・"） 。 9（ 0 / 比较 试 验 结 果 发 现， 实验室试验发酵罐 （ () /） 的结果要好于容积为 ( %3 的发酵罐， 而 ( %3 发酵罐 的试验结果则要优于 -) %3 发酵罐。表 面 看 起 来 是
图-
( %3 罐纯甘油厌氧批式流加发酵结果
收稿日期： 修回日期： "%%$ ) %/ ) "$ ； "%%$ ) !" ) !&
基金项目： 国家 “十五” 攻关项目 （ "%%&@6*!’@%$ ) %’） ； 国家 “ /*’” 项目 （ "%%’J@*!$%%%） 作者简介： 刘海军 （ !/$* ) ） ， 男， 博士生， 高级工程师； 修志龙 （ !/$2 ) ） ， 男， 博 士， 教 授， 博 士 生 导 师， 主 要 研 究 方 向 为 生 物 催 化 与 转 化， 通讯联系 人， %&!! ) 1&*%$’$/ ， UEFRAM V DFM< # 8DM # C=。 万方数据
。 但 从 !， ’) 丙 二 醇 生 产 。 我 国 !， ’) 丙 二 醇 的
技术研究的发展 趋 势 看， 已由相对成熟的化学合成 法向微生物 发 酵 法 过 渡
［2 ) /］
产量非常少， 仅有少数几家化学试剂厂生产， 而大宗 工业用 ! ， ’) 丙二醇仍需从国外进口。 笔者 所 在 课 题 组 在 实 验 室 试 验 研 究 基 础 上， 以
［! ) &］
甘油为原 料， 利用克雷伯氏菌 （ ; @ 7*<)?2*&%< ） 完成 了发酵法生产 ! ， ’) 丙二醇的中试研究。
!
!;!
材料与方法
试验材料 原始 ; @ 7*<)?2*&%< 菌 株 购 自 德 国 菌 种 和 细 胞
收集中心 （ 7WXY） ， 试验用菌株是 其经 过等离 子体诱 变和筛选的优良 菌 株， 种子和发酵培养基制取同文 献 ［!%］ 所示方法。发酵粗甘油是以淀粉为 原料经 微 生 物 发 酵 后 浓 缩 的 甘 油 溶 液， 甘油质量分数为 纯甘油是质量分数为 /1 0 的皂化甘油。 12 0 ； !;< 分析方法 甘油 浓 度 用 高 碘 酸 氧 化 法 测 定； 菌体浓度是以 蒸馏水为空白样， 用在波长 $2% =( 下 测得 的光密 度 Z7 值表示； !， ’) 丙二醇浓度 用 [J )!&@ 气相 色谱法 检测 （日本岛津 公 司） ， 色谱柱 （! 2 (( \ " (） 填料
万方数据 以纯甘油为原料， 容积规 模 为 ( %3 发 酵 罐 的 中
・ 21 ・
现代化工
第 &, 卷第 & 期 依据中试技 术 指 标， 结合该课题组提出的两步
反应器放大带来的负效应， 即随着发酵装置的增大， 目标产物的浓 度 反 而 下 降。 但 仔 细 分 析 会 发 现， 设 备和操作的差异是不容忽视的影响因素。中试采用 批式流加 底 物 发 酵 的 目 的 在 于 减 少 底 物 的 抑 制 作
作为重要的化 工原料， （!， 可 !， ’) 丙二 醇 ’)37） 用作溶剂、 抗冻剂、 保 护 剂、 精细化工原料以及药物 合成中间体等， 但其最主要的用途是作为单体与对 苯二甲酸合成新型聚酯材料— — —聚对苯二甲酸丙二 。 随 着 全 球 对 344 需 求 量 的 日 益 增 高， 对 酯 （ 344） 其关键原料 ! ， ’) 丙 二 醇 的 需 求 量 也 逐 渐 加 大。 据 壳牌 （ WE8FF） 公司 预 计， "%!% 年 全 世 界 344 产 量 可 达 到 !%% 万 < 以 上， 而 !， ’) 丙 二 醇 的 需 求 量 相 应 也 将 达到 ’% 万 < 左 右。目 前 ! ， ’) 丙 二 醇 的 工 业 化 生 产 方法为化学合成 法， 国际市场主要由壳牌公司和杜 邦 （ 7M 3>=<） 公司垄断
摘要： 以甘油为原料， 利用克雷伯氏菌进行了发酵罐容积规模分别为 ! (’ 和 "% (’ 的发酵法 ! ， ’) 丙 二 醇 生 产 的 中 试 研 究。 试验结果表明： ! (’ 和 "% (’ 的发酵罐最终发酵液中 ! ， ’) 丙二醇平均质量浓度分别达到了 *& + $ , - . 和 $’ + / , - .， !， ’) 丙 二 醇 相 对于甘油的得率分别为 $! + " 0 和 &/ + / 0 。采用发酵液醇沉预处理、 再精馏的专利技术可分离得到纯度大于 // 0 的 ! ， ’) 丙 二 醇 产品质量达到了聚对苯二甲酸丙二酯 （ 344） 聚 合 反 应 的 要 求。 成 本 分 析 表 明， 生 物 法 生 产 !， 产品， 分离收率大于 12 0 ， ’) 丙 二 醇技术是经济可行的。 关键词： 克雷伯氏菌； 甘油； 微生物发酵； 中试 !， ’) 丙二醇； 中图分类号： 45/"’ 文献标识码： 6 文章编号： （ "%%*） %"2’ ) &’"% %" ) %%2$ ) %’
3 3
同样以 中试首先利用 ( % 规模 的 发 酵 罐 进 行， 发酵粗甘油和纯甘油为原料进行了厌氧批式流加发 酵试验， 试验结果如图 ( 、 图 - 所 示。 从 试 验 结 果 可 以看出， 发酵粗甘 油 的 发 酵 结 果 比 纯 甘 油 的 发 酵 结 果要差些。在 33 4 ) " 的 发 酵 时 间 里， 以发酵粗甘油 为原料， 最终发酵液中 ( ， 35 丙二醇质量浓度为 :* 4 : 得率为 +* 4 + = ， 生产效率为 ( 4 7: 9 （ ・"） ； 而以 9 0 /， 0 / 纯甘油为原料发 酵 的 ( ， 35 丙 二 醇 质 量 浓 度 为 6* 4 : 得率为 :( 4 - = ， 生产效率为 - 4 -: 9 （ ・"） 。 9 0 /， 0 /
-))6 年 - 月
刘海军等： 微生物发酵法中试生产 ( ， 35 丙二醇
・ +6 ・
为 !"#$%&$#’ ()( 型填料， 柱温 (*+ , ， 汽化室与检测 流速 *) %/ 0 %12 ， 进 器的温度均为 -+) , ， 载气为 .- ， 样量为 ( ! 采用外标法测量。 /，
试试验结果基本 上 与 实 验 室 试 验 结 果 持 平， 个别指 标甚至高于实验 室 试 验 结 果， 说明该研究所采用的 工艺路线是可行的， 完全具有进行工程放大的能力。 另外， 以发酵粗甘油为原料的试验结果差于以 纯甘油为原料的 试 验 结 果 的 原 因 可 能 有 3 方 面： 首 先是由于发酵粗 甘 油 中 焦 糖 含 量 较 高， 在发酵控制 过程中， 无法用电磁阀实现自动控制， 只能人为手工 控制， 造成局部抑制现象； 二是发酵粗甘油本身浓度 不高， 质量分 数 仅 为 8+ = 左 右， 因此使得发酵液的 体积增大， 造 成 (， 三是发 35 丙 二 醇 产 品 含 量 较 低； 酵粗甘油原料本身其他杂质存在的影响。 -4-4-) %3 规模发酵罐的发酵试验结果 以纯甘油 为 原 以 ( %3 发酵罐中试试验为基础， 料， 进 行 了 容 积 规 模 为 -) %3 发 酵 罐 的 中 试 发 酵 试 验， 获得了更大规模的试验数据。 - 次 -) %3 规模发 酵罐的厌氧批式流加发酵试验结果分别如图 3 、 图* 所示。
$%&’()*+&, &- ! ， "./%&/0,1’+&2 34 5+)%&3+&2&6+)02 -1%51,*0*+&, &, 0 /+2&* 7)021
" " ，+$,-. /%&’(&% ! ，0# 12)’3%& !， ，4#- 1%’5&* ! ，!# 6&’7&*8 " ，9# 1&*8 ! ，0"# +3&’:2*8 ! !"# $%&’()* !，
（! # 789:;<(8=< >? @A>BCA8=C8 :=D @A><8CE=>F>,G，7:FA:= H=AI8;BA<G >? 48CE=>F>,G，7:FA:= !!$%"& ，JEA=:； " # 38<;>JEA=: K8B8:;CE L=B<A<M<8 >? NAFA= 38<;>CE8(AC:F J>(9:=G，NAFA= !’"%"! ，JEA=:） 837*%0)*：O8;(8=<:<AI8 9;>DMC<A>= >? ! ， ’P9;>9:=8DA>F ?;>( ,FGC8;>F QG ;:<=>&<::% 7*<)?2*&%< E:B Q88= C>=DMC<8D M9 <> <E8 BC:F8 >? ! (’ :=D "% (’ # 4E8 8R98;A(8=<:F ;8BMF<B BE>S8D <E:< <E8 ?A=:F (:BB C>=C8=<;:<A>=， (>F:; GA8FD >? ! ， ’P9;>9:=8DA>F <> ,FGC8;>F S8;8 *& + $ , - . :=D $! + " 0 A= ! (’ ;8:C<>;， $’ + / , - . :=D &/ + / 0 A= "% (’ ;8:C<>;， ;8B98C<AI8FG # @G MBA=, 8<E:=>F 9;8CA9A<:<AI8 9;8<;8:<(8=< :=D ;8C<A?AC:<A>= 9:<8=< <8CE=>F>,G， <E8 9;>DMC< ! ， ’P9;>9:=8DA>F SA<E 9M;A<G >? // 0 E:D Q88= E:;I8B<8D， <E8 B898;:<A>= GA8FD >? ! ， ’P9;>9:=8DA>F S:B ,;8:<8; <E:= 12 0 ， :=D <E8 9;>DMC< TM:FA<G E:D (8< <E8 9>FG(8;AU:<A>= B<:=D:;D # 4E8 C>B< :=:FGBAB D8(>=B<;:<8D <E:< <E8 (AC;>QA:F 9;>DMC<A>= >? ! ， ’P9;>9:=8DA>F S:B 8C>=>(AC:FFG ?8:BAQF8 # 914 :&%’7：! ， ’P9;>9:=8DA>F；;:<=>&<::% 7*<)?2*&%< ；,FGC8;>F；(AC;>QA>F>,AC:F ?8;(8=<A>=；9AF>< BC:F8
现代化工 X>D8;= JE8(AC:F L=DMB<;G
第 "* 卷第 " 期 "%%* 年 " 月
微生物发酵法中试生产 ! ， "# 丙二醇
" " 刘海军! ， ， 张代佳! ， 徐友海! ， ， 孙亚琴! ， 吕继萍" ， 牟
英! ， 修志龙!
（! # 大连理工大学生物科学与工程系， 辽宁 大连 !!$%"& ； 吉林 吉林 !’"%"!） " # 中国石油吉林石化分公司研究院，
(— (， 35 丙二醇； - —菌体浓度； 3 —纯甘油
图3
-) %3 罐纯甘油厌氧批式流加发酵结果
(— (， 35 丙二醇； - —粗甘油
图(
( %3 罐发酵粗甘油厌氧批式流加发酵结果
(— (， 35 丙二醇； - —菌体浓度； 3 —纯甘油
图*
-) %3 罐纯甘油厌氧批式流加发酵结果
从发酵结果可以看出， -) %3 发酵罐试验结果要 差于 ( %3 发 酵 罐 的 试 验 结 果。 在 相 同 的 发 酵 时 间 里， - 次发酵结果的平均 数 据 如 下： (， 35 丙 二 醇 质 量 浓度为 :3 4 7 9 0 /， 得 率 为 *7 4 7 = ， 生 产 效 率 为 ( 4 86
!
!"#
结果与讨论
实验室试验结果 实验室试验在 () / 发酵 罐 中 进 行， 分别考察了
发酵粗甘油和纯甘油为原料的发酵试验。以发酵粗 甘油为原料的发酵试验 共 进 行 了 3) 4 ) " ， 产 物 (， 35 丙二醇最高质量浓度为 67 4 78 9 0 /， 生产效率 为 - 4 :( ・"） ； 以纯甘油为原料的发酵试验共进行了 9（ 0 / *) 4 + "， ;< 值达到 (* 4 )) 以上， (， 35 丙二醇最 高 质 量 浓度为 8( 4 *+ 9 0 /， 生产效率为 - 4 )( 9 （ ・"） 。 0 / !"! -4-4( 中试结果 ( % 规模发酵罐的发酵试验结果
(— (， 35 丙二醇； - —菌体浓度； 3 —纯甘油
・"） 。 9（ 0 / 比较 试 验 结 果 发 现， 实验室试验发酵罐 （ () /） 的结果要好于容积为 ( %3 的发酵罐， 而 ( %3 发酵罐 的试验结果则要优于 -) %3 发酵罐。表 面 看 起 来 是
图-
( %3 罐纯甘油厌氧批式流加发酵结果
收稿日期： 修回日期： "%%$ ) %/ ) "$ ； "%%$ ) !" ) !&
基金项目： 国家 “十五” 攻关项目 （ "%%&@6*!’@%$ ) %’） ； 国家 “ /*’” 项目 （ "%%’J@*!$%%%） 作者简介： 刘海军 （ !/$* ) ） ， 男， 博士生， 高级工程师； 修志龙 （ !/$2 ) ） ， 男， 博 士， 教 授， 博 士 生 导 师， 主 要 研 究 方 向 为 生 物 催 化 与 转 化， 通讯联系 人， %&!! ) 1&*%$’$/ ， UEFRAM V DFM< # 8DM # C=。 万方数据
。 但 从 !， ’) 丙 二 醇 生 产 。 我 国 !， ’) 丙 二 醇 的
技术研究的发展 趋 势 看， 已由相对成熟的化学合成 法向微生物 发 酵 法 过 渡
［2 ) /］
产量非常少， 仅有少数几家化学试剂厂生产， 而大宗 工业用 ! ， ’) 丙二醇仍需从国外进口。 笔者 所 在 课 题 组 在 实 验 室 试 验 研 究 基 础 上， 以
［! ) &］
甘油为原 料， 利用克雷伯氏菌 （ ; @ 7*<)?2*&%< ） 完成 了发酵法生产 ! ， ’) 丙二醇的中试研究。
!
!;!
材料与方法
试验材料 原始 ; @ 7*<)?2*&%< 菌 株 购 自 德 国 菌 种 和 细 胞
收集中心 （ 7WXY） ， 试验用菌株是 其经 过等离 子体诱 变和筛选的优良 菌 株， 种子和发酵培养基制取同文 献 ［!%］ 所示方法。发酵粗甘油是以淀粉为 原料经 微 生 物 发 酵 后 浓 缩 的 甘 油 溶 液， 甘油质量分数为 纯甘油是质量分数为 /1 0 的皂化甘油。 12 0 ； !;< 分析方法 甘油 浓 度 用 高 碘 酸 氧 化 法 测 定； 菌体浓度是以 蒸馏水为空白样， 用在波长 $2% =( 下 测得 的光密 度 Z7 值表示； !， ’) 丙二醇浓度 用 [J )!&@ 气相 色谱法 检测 （日本岛津 公 司） ， 色谱柱 （! 2 (( \ " (） 填料
万方数据 以纯甘油为原料， 容积规 模 为 ( %3 发 酵 罐 的 中
・ 21 ・
现代化工
第 &, 卷第 & 期 依据中试技 术 指 标， 结合该课题组提出的两步
反应器放大带来的负效应， 即随着发酵装置的增大， 目标产物的浓 度 反 而 下 降。 但 仔 细 分 析 会 发 现， 设 备和操作的差异是不容忽视的影响因素。中试采用 批式流加 底 物 发 酵 的 目 的 在 于 减 少 底 物 的 抑 制 作
作为重要的化 工原料， （!， 可 !， ’) 丙二 醇 ’)37） 用作溶剂、 抗冻剂、 保 护 剂、 精细化工原料以及药物 合成中间体等， 但其最主要的用途是作为单体与对 苯二甲酸合成新型聚酯材料— — —聚对苯二甲酸丙二 。 随 着 全 球 对 344 需 求 量 的 日 益 增 高， 对 酯 （ 344） 其关键原料 ! ， ’) 丙 二 醇 的 需 求 量 也 逐 渐 加 大。 据 壳牌 （ WE8FF） 公司 预 计， "%!% 年 全 世 界 344 产 量 可 达 到 !%% 万 < 以 上， 而 !， ’) 丙 二 醇 的 需 求 量 相 应 也 将 达到 ’% 万 < 左 右。目 前 ! ， ’) 丙 二 醇 的 工 业 化 生 产 方法为化学合成 法， 国际市场主要由壳牌公司和杜 邦 （ 7M 3>=<） 公司垄断
摘要： 以甘油为原料， 利用克雷伯氏菌进行了发酵罐容积规模分别为 ! (’ 和 "% (’ 的发酵法 ! ， ’) 丙 二 醇 生 产 的 中 试 研 究。 试验结果表明： ! (’ 和 "% (’ 的发酵罐最终发酵液中 ! ， ’) 丙二醇平均质量浓度分别达到了 *& + $ , - . 和 $’ + / , - .， !， ’) 丙 二 醇 相 对于甘油的得率分别为 $! + " 0 和 &/ + / 0 。采用发酵液醇沉预处理、 再精馏的专利技术可分离得到纯度大于 // 0 的 ! ， ’) 丙 二 醇 产品质量达到了聚对苯二甲酸丙二酯 （ 344） 聚 合 反 应 的 要 求。 成 本 分 析 表 明， 生 物 法 生 产 !， 产品， 分离收率大于 12 0 ， ’) 丙 二 醇技术是经济可行的。 关键词： 克雷伯氏菌； 甘油； 微生物发酵； 中试 !， ’) 丙二醇； 中图分类号： 45/"’ 文献标识码： 6 文章编号： （ "%%*） %"2’ ) &’"% %" ) %%2$ ) %’
3 3
同样以 中试首先利用 ( % 规模 的 发 酵 罐 进 行， 发酵粗甘油和纯甘油为原料进行了厌氧批式流加发 酵试验， 试验结果如图 ( 、 图 - 所 示。 从 试 验 结 果 可 以看出， 发酵粗甘 油 的 发 酵 结 果 比 纯 甘 油 的 发 酵 结 果要差些。在 33 4 ) " 的 发 酵 时 间 里， 以发酵粗甘油 为原料， 最终发酵液中 ( ， 35 丙二醇质量浓度为 :* 4 : 得率为 +* 4 + = ， 生产效率为 ( 4 7: 9 （ ・"） ； 而以 9 0 /， 0 / 纯甘油为原料发 酵 的 ( ， 35 丙 二 醇 质 量 浓 度 为 6* 4 : 得率为 :( 4 - = ， 生产效率为 - 4 -: 9 （ ・"） 。 9 0 /， 0 /
-))6 年 - 月
刘海军等： 微生物发酵法中试生产 ( ， 35 丙二醇
・ +6 ・
为 !"#$%&$#’ ()( 型填料， 柱温 (*+ , ， 汽化室与检测 流速 *) %/ 0 %12 ， 进 器的温度均为 -+) , ， 载气为 .- ， 样量为 ( ! 采用外标法测量。 /，
试试验结果基本 上 与 实 验 室 试 验 结 果 持 平， 个别指 标甚至高于实验 室 试 验 结 果， 说明该研究所采用的 工艺路线是可行的， 完全具有进行工程放大的能力。 另外， 以发酵粗甘油为原料的试验结果差于以 纯甘油为原料的 试 验 结 果 的 原 因 可 能 有 3 方 面： 首 先是由于发酵粗 甘 油 中 焦 糖 含 量 较 高， 在发酵控制 过程中， 无法用电磁阀实现自动控制， 只能人为手工 控制， 造成局部抑制现象； 二是发酵粗甘油本身浓度 不高， 质量分 数 仅 为 8+ = 左 右， 因此使得发酵液的 体积增大， 造 成 (， 三是发 35 丙 二 醇 产 品 含 量 较 低； 酵粗甘油原料本身其他杂质存在的影响。 -4-4-) %3 规模发酵罐的发酵试验结果 以纯甘油 为 原 以 ( %3 发酵罐中试试验为基础， 料， 进 行 了 容 积 规 模 为 -) %3 发 酵 罐 的 中 试 发 酵 试 验， 获得了更大规模的试验数据。 - 次 -) %3 规模发 酵罐的厌氧批式流加发酵试验结果分别如图 3 、 图* 所示。
$%&’()*+&, &- ! ， "./%&/0,1’+&2 34 5+)%&3+&2&6+)02 -1%51,*0*+&, &, 0 /+2&* 7)021
" " ，+$,-. /%&’(&% ! ，0# 12)’3%& !， ，4#- 1%’5&* ! ，!# 6&’7&*8 " ，9# 1&*8 ! ，0"# +3&’:2*8 ! !"# $%&’()* !，
（! # 789:;<(8=< >? @A>BCA8=C8 :=D @A><8CE=>F>,G，7:FA:= H=AI8;BA<G >? 48CE=>F>,G，7:FA:= !!$%"& ，JEA=:； " # 38<;>JEA=: K8B8:;CE L=B<A<M<8 >? NAFA= 38<;>CE8(AC:F J>(9:=G，NAFA= !’"%"! ，JEA=:） 837*%0)*：O8;(8=<:<AI8 9;>DMC<A>= >? ! ， ’P9;>9:=8DA>F ?;>( ,FGC8;>F QG ;:<=>&<::% 7*<)?2*&%< E:B Q88= C>=DMC<8D M9 <> <E8 BC:F8 >? ! (’ :=D "% (’ # 4E8 8R98;A(8=<:F ;8BMF<B BE>S8D <E:< <E8 ?A=:F (:BB C>=C8=<;:<A>=， (>F:; GA8FD >? ! ， ’P9;>9:=8DA>F <> ,FGC8;>F S8;8 *& + $ , - . :=D $! + " 0 A= ! (’ ;8:C<>;， $’ + / , - . :=D &/ + / 0 A= "% (’ ;8:C<>;， ;8B98C<AI8FG # @G MBA=, 8<E:=>F 9;8CA9A<:<AI8 9;8<;8:<(8=< :=D ;8C<A?AC:<A>= 9:<8=< <8CE=>F>,G， <E8 9;>DMC< ! ， ’P9;>9:=8DA>F SA<E 9M;A<G >? // 0 E:D Q88= E:;I8B<8D， <E8 B898;:<A>= GA8FD >? ! ， ’P9;>9:=8DA>F S:B ,;8:<8; <E:= 12 0 ， :=D <E8 9;>DMC< TM:FA<G E:D (8< <E8 9>FG(8;AU:<A>= B<:=D:;D # 4E8 C>B< :=:FGBAB D8(>=B<;:<8D <E:< <E8 (AC;>QA:F 9;>DMC<A>= >? ! ， ’P9;>9:=8DA>F S:B 8C>=>(AC:FFG ?8:BAQF8 # 914 :&%’7：! ， ’P9;>9:=8DA>F；;:<=>&<::% 7*<)?2*&%< ；,FGC8;>F；(AC;>QA>F>,AC:F ?8;(8=<A>=；9AF>< BC:F8