第十九章 补体检测及应用

第十九章补体检测及应用
补体是一组存在于人和脊椎动物血清中具有酶样活性、不耐热的糖蛋白。

补体不是单一成分，其在功能效应上是以连续反应程序进行的，故又称补体系统。

补体的存在与抗原性异物的刺激无关，在正常人血清中，其含量相对稳定，但在某些疾病发生时，补体的含量及其活性可发生改变。

第一节概述
一、补体成分的含量与理化特性
（一）补体成分的含量
补体大多为糖蛋白，属于β球蛋白，C1q、C8等为γ球蛋白，C1s、C9为α球蛋白。

正常血清中补体各组分含量相差较大，其中C3含量最高。

补体活化后的裂解片段以该成分的符号后加小写英文字母表示，通常a为小片段，b为大片段，但C2a 为大片段，C2b为小片段。

体内合成补体成分的部位和细胞有多种，以肝脏、脾脏、小肠等组织和巨噬细胞、上皮细胞、血小板等细胞为主。

（二）补体的理化特性
补体的性质不稳定，易受各种理化因素的影响，加热、紫外线照射、机械振荡、酸碱和酒精等因素均可破坏补体。

在-10℃活性保持3～4天，冷冻干燥可较长时间保持其活性，加热56℃30分钟灭活（灭能），故补体活性检测应尽快进行。

标本保存应置于-20℃以下。

二、补体的活化途径
1.经典途径
是以抗原-抗体复合物结合C1q启动激活的途径，最早被人们所认识，故又称第一途径或传统途径，是抗体介导的体液免疫应答的主要效应方式。

2.MBL途径
是甘露聚糖结合凝集素（MBL）结合至细菌启动的途径。

其诱导物或激活剂是机体的炎症反应急性期时相性蛋白产生的MBL和C反应蛋白等，后者与病原体结合而启动绕过C1的MBL途径。

3.旁路途径
是通过微生物表面等膜性物质，从C3开始，由B因子、D因子参与激活过程，也称第二途径、旁路途径。

这种激活方式不依赖于特异性抗体的形成，在感染早期可为机体提供有效的防御机制。

第二节补体总活性测定
已应用于科研和临床的方法包括：基于经典途径的CP-CH50和应用于C3旁路检测的AP-CH50。

CP-CH50是临床常规进行的补体总活性检测项目，AP-CH50尚未列入检验常规。

而MBL途径活性测定的可靠方法暂未建立。

因此，通常述及的CH50系指CP-CH50。

（一）CH50测定法的原理
补体最主要的活性是溶细胞作用。

特异性抗体与红细胞结合后可激活补体，导致红细胞表面形成跨膜小孔，使胞外水分渗入，引起红细胞肿胀而发生溶血。

补体溶血程度与补体的活性相关，但非直线关系。

在一个适当的、稳定的反应系统中，溶血反应对补
体的剂量依赖呈一特殊的S形曲线。

以溶血百分率为纵坐标，相应血清量为横坐标，可见在轻微溶血和接近完全溶血时，对补体量的变化不敏感。

S形曲线在30%～70%之间最陡，几乎呈直线，补体量的少许变动，也会造成溶血程度的较大改变，即曲线此阶段对补体量的变化非常敏感。

因此，实验常以50%溶血作为终点指标，它比100%溶血更为敏感，这一方法称为补体50%溶血实验（50%complement hemolysis），即CH50。

（二）CH50测定方法
在正式试验之前，应调制红细胞浓度、滴定溶血素效价。

1.红细胞浓度的调整
2.溶血素滴定
3.稀释缓冲液磷酸缓冲液或巴比妥缓冲液等均可用于溶血试验。

4.50%溶血标准管做CH50试验时，应同时配制50%溶血标准管。

5.50%溶血总补体值的计算
（三）方法评价与临床意义
CH50测定补体活性，方法简便、快速，虽敏感性较低，但可以满足对血清补体含量测定的要求。

该法主要检测的是补体经典途径的溶血活性，所得结果反映补体C1～C9等9种成分的综合水平。

严重肝病或营养不良时，由于蛋白合成障碍，可不同程度地引起血清补体水平的下降。

在细菌感染，特别是革兰阴性细菌感染时，常因补体旁路途径的活化而引起血清补体水平的过度降低。

心肌梗死、甲状腺炎、大叶性肺炎、糖尿病、妊娠等情况下，血清补体水平常见升高。

补体检测常可用于自身免疫病的诊断，也可作为某些疾病活动期的参考指标。

第三节单个补体成分的测定
在30多种补体成分中，C3、C4、C1q、B因子和C1酯酶抑制物等，常被作为单个补体成分的检测指标。

测定方法为免疫溶血法和基于抗原抗体反应的血清学法（免疫化学法），前者用来检测单个补体成分的活性，后者可测定其含量。

目前应用自动化免疫散射比浊法可准确测定体液中C3、C4等多个单一的补体成分。

一、免疫溶血法
溶血法主要根据抗原与其特异性抗体（IgG、IgM型）结合后可激活补体的经典途径，导致细胞溶解。

该方法中抗原为SRBC，抗体为兔或马抗SRBC的抗体，即溶血素，将两者组合作为指示系统参与反应。

试验中有两组补体参与，一组是作为实验反应系统的补体，选用或制备缺少待测成分的试剂（R试剂），此类试剂可选用先天缺乏某单一补体成分的动物或人血清。

另一组为待测血清中的补体，当加入待测血清，使原来缺乏的成分得到补偿，补体成分齐全，级联反应恢复，产生溶血。

采用免疫溶血法检测待测标本中某一单个补体成分是否缺乏，可以帮助诊断补体某个成分缺失或其含量正常但无溶血活性的先天性补体缺陷。

该法不是检测某补体成分的具体含量，而是检测其活性，在某些需了解该成分活性情况下，本试验适用。

二、免疫化学法
免疫化学法，分为单向免疫扩散、火箭免疫电泳、透射比浊法和散射比浊法。

前两种方法手工操作繁琐，耗时长，影响因素多，结果重复性差，已趋于淘汰。

后两种方法可通过仪器对补体的C3、C4、B因子等单个成分进行自动化测定。

待测血清标本中的C3、C4成分，经适当稀释后与相应抗体反应形成复合物，反应介质中的PEG可使该复合物沉淀，仪器对复合物产生的光散射或透射信号进行自动检测，并换算成所测成分的浓度单位。

第四节补体结合试验
补体结合试验（CFT），是将免疫溶血作为指示系统，用以检测另一反应系统中抗原或抗体的传统方法。

早在1906年Wassermann就将其应用于梅毒的诊断，即著名的华氏反应。

该方法并非用于补体的检测，而是利用补体的溶细胞作用进行各种物理状态的抗原抗体测定。

一、试验原理
试验有5种成分参与反应，分属3个系统：
1.反应系统已知抗原（或抗体）与待测抗体（或抗原）。

2.补体系统
3.指示系统 SRBC与相应溶血素，试验时常将其预先结合，成为致敏绵羊红细胞（sensitized sheep red blood cell，SRBCs）。

因免疫复合物对补体的活化无特异性，既能被反应系统激活，也能与指示系统结合。

首先是反应系统与补体的作用。

第二步是指示系统利用剩余补体的反应。

如反应系统中有抗体或抗原，则形成免疫复合物而固定和消耗补体，使后加入的SRBC-抗SRBS指示系统无多余补体可利用，则无溶血反应发生，反之亦然。

因此，不溶血为补体结合试验阳性，而溶血为试验阴性。

试验中将反应系统的待测抗原（或抗体）作系列倍比稀释可作半定量测定。

试验中以50%不溶血作为判断终点。

二、试验方法
（一）试剂的准备
1.抗原或抗体
2.补体在补体结合试验中，采用豚鼠血清为补体。

3.待测标本采血并及时分离血清用于检测或-20℃保存备用；试验前，应先将血清56℃加热30分钟（或60℃3分钟）以灭活补体。

（二）正式试验
根据反应体积的大小，有小量法、微量法等，其中小量法较为常用。

三、方法评价
补体结合试验是一经典的免疫技术，具有灵敏度高、可检测的抗原或抗体范围广泛等优点。

第五节补体受体的测定
补体受体存在于多种细胞，是清除免疫复合物、净化机体内环境的重要膜性成分。

在若干补体成分中，C3是各活化途径的交汇点，且含量最多。

第六节补体测定的应用
补体相关试验：
用于诊断梅毒螺旋体感染的华氏反应；
HLA分型的补体依赖性细胞毒试验；
抗原抗体检测的脂质体免疫试验、免疫粘连血凝试验；
抗体形成细胞定量检测的溶血空斑技术；
免疫复合物测定的胶固素结合试验；
C1q结合试验。

应用于补体含量和活性检测的试验包括：
反映总补体活性的AP-CH50和AP-H50试验。

用于检测补体单个成分及其裂解产物（C1q、C3SP、C3、C4、B因子等）和补体受体的溶血试验。

免疫化学试验。

免疫荧光技术。

与补体含量和活性相关的疾病，主要包括以下几类：
1.免疫相关性疾病。

2.与补体有关的遗传性疾病。

3.补体含量显著降低的疾病。

4.高补体血症。