二氯荧光素最大激发波长和最大发射波长的测定(1)

二氯荧光素最大激发波长和最大发射波长的测定
实验室地点：3411
实验时间安排
9.20（第5周星期二）
8:30—10:00 第3组
10:00—11:30 第4组
9.21（第5周星期三）
14:30—16:00 第5组
16:00—17:30 第6组
9.22（第5周星期四）
8:30—10:00 第7组
9.23（第5周星期五）
14:30—16:00 第1组
16:00—17:30 第2组
实验指导
一、实验目的
1．掌握二氯荧光素最大激发波长和最大发射波长的测量方法；
2．学会辩别荧光物质的分子荧光峰和拉曼散射峰；
3．熟悉岛津RF-5301（日立F-4500）荧光分光光度计的定性扫描方法及定性测量软件数据处理操作。

二、实验原理
任何荧光物质都具有激发光谱和发射光谱。

由于斯托克斯位移，荧光发射波长总是大于激发波长。

在一定光源强度下，若保持激发波长ex λ不变，扫描得到的荧光强度与发射波长em λ的关系曲线，称为荧光发射光谱，它表示在所发射的荧光中各种波长组分的相对强度；反之，保持em λ不变，扫描得到的荧光强度与ex λ的关系曲线，则
称为荧光激发光谱，它可以反映不同波长激发光引起荧光的相对效率。

由于各种不同的荧光物质有它们各自特定的荧光发射波长值，所以，可用它来鉴别各种荧光物质。

在一定条件下，荧光强度与物质浓度成正比，这是荧光定量分析的基础。

荧光分析的灵敏度不仅与溶液的浓度有关，而且与紫外光照射强度及所选测量波长等因素有关。

同一荧光物质的分子荧光发射光谱曲线的波长范围（和最大发射波长）不因它的激发波长值的改变而位移，由于这一荧光特性，如果固定荧光发射波长（λem），然后改变激发波长（λex），并以荧光强度F对激发光波长λex绘图即获得激发光谱曲线，从中能确定最大激发波长（λex）。

反之，固定激发波长值，测定不同发射波长时的荧光强度，即得荧光发射光谱曲线和最大荧光发射波长值。

三、仪器和试剂
1、仪器荧光分光光度计（岛津RF-5301，日立F-4500）。

它的主要技术指标如下：测量波长范围：220-900 nm，（200-900 nm）、光源：脉冲氙灯、测量模式：激发光谱，发射光谱，波长同步光谱，测量方式：定性、定量、三维扫描、荧光动力学
四面通石英比色皿一个（10mm x 10mm）、25 mL具塞比色管、移液管、吸耳球、洗瓶、吸水纸
2、试剂
(1) 二氯荧光素标准溶液
a 储备标准液(25mg/mL): 称取0.0125g 二氯荧光素（A.R），用0.01mol·L－1 NaOH溶液溶解后移入500mL容量瓶中并用0.10 mol·L－1 NaOH稀释至刻度。

b 工作标准液(0.10 mg/mL):取上述储备溶液10.00mL于一500mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度摇匀，配制成0.50mg/mL溶液。

再移取0.50mg/mL溶液10.00mL于一50mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度摇匀。

（2）1.0mol·L－1 NaOH
四、实验步骤
1．取25mL具塞比色管，加入上述二氯荧光素工作标准溶液5.00mL，然后加入1.0mol·L－1NaOH 1.0mL，用蒸馏水稀释到刻度摇匀。

2．打开计算机、打印机和荧光光度计主机，预热5分钟。

3．对荧光光度计进行仪器初始化。

4．依次在激发波长值分别为340nm /350nm /360nm，波长扫描范围为200-750nm，激发和发射波长狭缝宽度分别为5nm，响应时间为10nm，扫描速度为1200时扫描二氯荧光素的各发射光谱图，并且通过叠加的三份谱图分析和确定二氯荧光素的荧光发射峰。

再确定最大发射波长值。

同时查看其拉曼波长、瑞利散射波长、以及双倍频峰波长。

5. 同理，固定最大发射波长扫描激发光谱图。

从图中确定二氯荧光素的荧光激发峰。

再确定最大激发波长值。

数据及处理
分别根据各自峰的特点，确定二氯荧光素最大激发波长、最大发射波长及指出拉曼峰、瑞利峰、双倍频峰。