2023-生物化学课件 第五章蛋白质的共价结构

二硫键的断裂：几条多肽链通过二硫键交 联在一起。可在可用8mol/L尿素或 6mol/L盐酸胍存在下，用过量的 -巯基 乙醇处理，使二硫键复原为巯基，然后 用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止 它重新被氧化。可以通过参加盐酸胍方 法解离多肽链之间的非共价力；应用过 甲酸氧化法或巯基复原法拆分多肽链间 的二硫键。
一蛋级 白结质构一测 级定结策构略测定步骤
蛋白质一级结构测定的步骤
1、蛋白质的别离纯化
2、测定蛋白质分子中多肽链的数目
3、亚基别离
4、二硫键的拆分与保护
5、分析每一多肽链的氨基酸组成
6、鉴定多肽链的N-末端和C-末端残基
7 、多种方法的局部水解
8、测序
9、重叠
10 、二硫键位置确实定
N端的测定方法
SEO
• PS
WTOU
• EOVE
VERL
• RLA
APS
• HOWT
HO
• 借助重叠肽确定肽段次序：
• 末端残基 H
S
• 末端肽段HOWT
APS 或
•
OUS
• 第一套肽段：HOWT OUS EOVE RLA PS
• 第二套肽段：HO WTOU SEO VERL APS
• 推断全序列: HOWTOUSEOVERLAPS
多种方法确定
酶解法末端测序
酶解法末端测序
利用外切蛋白水解酶 (exo-peptidase) 将肽链的氨基酸从N端 (aminopeptidase) 或C端 (carboxypeptidase) 一个接一个游 离出来， 在不同时间取样进行分析，根 据所游离的氨基酸的摩尔数的多少来判
断氨基酸的排列顺序。
quanternary structure 四级结构： 蛋白质多聚体
1969年正式将一级结构定义为氨基酸序列和双硫 键的位置。
介于二级结构和三级结构之间还存在超二级结构
〔二级结构的组合〕和结构域〔在空间上相对独立〕 这两个层次。
肽基的C、O和N原子间的共振相互作用
sp3 sp2
sp2 sp2
胰蛋白酶〔trypsin〕；
Lys-X, Arg-X (X≠Pro)
胰糜乳蛋白酶〔chymotrypsin〕；Y-X〔Y=Phe,Trp,Tyr;
X≠Pro)
嗜热菌蛋白酶〔thermolysin〕；
木瓜蛋白酶〔papain〕；
X-Y (X=R, K,Q, H, Y)
胃蛋白酶〔pepsin〕；
枯草杆菌碱性蛋白酶〔subtilisin〕
C端的测定方法
1、肼法 2、复原法 3、酶降解法
肼法C端测定
肼(hydrazine)法测定
蛋白质与无水肼加热
-------NH-CH-CONH-CH-COOH
|
|
Rx
Ry
＋NH2NH2，100℃，5～10h
-- + -- + NH-CH-CONH-NH2 + NH2-CH-COOH
|
|
Rx
Ry
溶于有机溶剂而被除去
Sanger试剂标记测序
ABCDE ↓ FDNB
*ABCDE ↓ 局部水解
*A，*AB，*ABC，*ABCD，*ABCDE ↓ 完全水解
*A,*A+B,… … *A+B+C+D+E ↓ FDNB
*A,*A+*B,… … *A+*B+*C+*D+*E
1234 5 结论：A B C D E
酰化反响
CH3 CH3 N
CH3 CH3 N
H2N—CH—COOH +
pH9.7
R
O=S=O 40℃ O=S=O
S-Cl）
R
DNS-氨基酸
取代DNFB测定蛋白质N端氨基酸，灵敏度高
氨基酸与苯异硫氰酯〔PITC〕的反响 〔Edman反响〕
+
PITC〔phenylisothiocyanate〕 弱硷中 (400 C)
(硝基甲烷 400 C) H+
苯乙内酰硫脲衍生物(PTH-AA) （phenylisothiohydantion-AA）
Edman降解法1
Edman 降解法(I)
DABITC ：有色Edman试剂 在Edman试剂上加发色基团
Edman降解法2
Edman 降解法(II)
无冕英雄Pehr Victor Edman
化学法专一性水解
肽键的专一性水解(化学法)
化学法: BrCN, H+, NH2OH, etc
消化道内几种蛋白酶的专一性
氨肽酶
〔Phe.Tyr.Trp〕
〔Arg.Lys〕
羧羧肽肽酶酶
〔Phe. Trp〕
〔脂肪族〕
胃蛋白酶
胰凝乳 弹性蛋白酶 胰蛋白酶 蛋白酶
酶法专一性水解
肽键的专一性水解(酶法)
泛用酶：
共振杂化体
共振产生的重要结果：•限制绕肽键的自由旋转 •形成酰胺平面 •产生键的平均化 •肽键呈反式构型
历史上第一个被确定 氨基酸序列的蛋白质
胰岛素
insulin
胰岛素的历史 第一个生化药物
• 最小的蛋白质，由A链(21 AA)和B (30 AA)组成；动物胰腺ß 细胞分泌的一种激 素,告诉细胞往里面运输糖、氨基酸、K+；
1、Sanger〔二硝基氟苯〕法 2、丹磺酰氯法 3、Edman法 4、酶降解法
氨基酸与2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反响 〔sanger反响〕
+
DNFB〔dinitrofiuorobenzene〕
弱碱中
氨基酸
DNP-AA(黄色)
+ HF
Sanger试剂标记反响
Sanger试剂(FDNB)标记N末端
专一酶：
Lys-X; X-Lys; Arg-X; Glu-X; X-Asp; Pro-X;
Asn-X , 商品名：Endoproteinase Asn-C
氨基酸确实定
氨基酸的鉴定、别离纯化
PTH-AA
太短在多肽链中次序的决定
• 资料：N-末端残基H,C-末端残基S;
• 第一套肽段 第二套肽段
• OUS
第五章
蛋白质的共价结构
蛋白质结构层次
蛋白质的结构层次
1952年丹麦人Linderstrom-Lang最早提出蛋白质的 结构可以分成四个层次:
primary structure
一级结构：
氨基酸序列
secondary structure 二级结构： α螺旋，β折叠
tertiary structure 三级结构：所有原子空间位置
• 1921年Banting & Best 从胰腺中抽提 出了有活性的胰岛素，1923年Banting & Macleod获Nobel医学奖；
• 1943－53年，Sanger确定了牛胰岛素 的一级结构，1958年获得Nobel化学奖；
• 1981年，Berg〔因DNA重组技术得奖〕 在大肠杆菌中表达了人胰岛素.