扶正祛毒方对慢性乙肝病毒携带小鼠肝组织γ-干扰素和白介素-10表达影响的研究

扶正祛毒方对慢性乙肝病毒携带小鼠肝组织γ-干扰素和白介
素-10表达影响的研究
彭龙;张立平;郭子宁;王炳然;袁慧鑫
【摘要】目的观察扶正祛毒方对慢性乙肝病毒携带小鼠γ-干扰素(Interferon-γ,IFN-γ)和白介素10(Interleukin-10,IL-10)表达影响,探讨扶正祛毒方对免疫的调
节作用.方法选择雄性HBV转基因C57BL/6J小鼠30只随机分为模型组、西药组、中药组,同系雄性正常小鼠10只作为空白组,西药组、中药组分别予以阿德福韦酯
药液和扶正祛毒方药液灌胃,模型组、空白组均予以等量生理盐水灌胃.24周后处死取材,检测血清乙型肝炎核心相关抗原(hepatitis B eantigen,HBeAg)、乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)水平,丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate transaminase,AST)含量,尾尖乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(hepatitis B virus deoxyribonucleic acid,HBV DNA)相对表达量,肝组织γ-干扰素、白介素-10含量.结果 (1)ALT、AST:模型组较空白组
显著升高(P＜0.05),西药组和中药组较模型组显著降低(P＜0.05).(2)HBeAg、HBsAg:模型组HBeAg、HBsAg阳性率均为100％,空白组均为0％,西药组、中药组HBeAg阴转率分别为28.6％、42.9％.(3) HBV DNA:模型组较空白组显著升高(P＜0.05),中药组较模型组显著降低(P＜0.05).(4)γ-干扰素:模型组较空白组显著降低(P＜0.05),中药组显著高于模型组(P＜0.05).(5)白介素-10:模型组较空白组显著
升高(P＜0.05),中药组显著低于模型组和西药组(P＜0.05).结论 (1)用药24周后,扶
正祛毒方对慢乙肝病毒携带小鼠肝脏炎症反应无加剧,并能降低血清转氨酶水平;(2)用药24周后,扶正祛毒方对慢性乙肝病毒携带小鼠病毒复制有抑制作用;(3)用药24周后,扶正祛毒方可以提高慢性乙肝病毒携带小鼠肝组织γ-干扰素表达,并抑制白介素-10表达,这可能是其抑制病毒复制的重要机制之一.
【期刊名称】《环球中医药》
【年(卷),期】2019(012)006
【总页数】4页(P835-838)
【关键词】慢性乙肝病毒携带者;扶正祛毒方;免疫调节;γ-干扰素;白介素-10
【作者】彭龙;张立平;郭子宁;王炳然;袁慧鑫
【作者单位】100078 北京中医药大学东方医院;100078 北京中医药大学东方医院消化科;100078 北京中医药大学东方医院感染科;100078 北京中医药大学东方医院;100078 北京中医药大学东方医院
【正文语种】中文
【中图分类】R285.5
慢性乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)携带指乙肝病毒感染后肝脏无明显炎症活动的携带状态，此时宿主多处于免疫耐受期，具有“HBV高水平复制”和“转氨酶保持正常或低水平”两大特点[1]。

慢性乙肝携带者虽然没有明显的临床症状表现，但是传染性强、病情进展风险高，常隐匿进展为肝硬化或肝癌[2]。

其诊断标准为：乙型肝炎核心相关抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg)、乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)和乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(hepatitis B virus deoxyribonucleic acid，HBV DNA)阳性者，1年内连续随访3次，每次至少间隔3个月，均显示血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草转氨酶(aspartate transaminase，AST)在正常范围，HBV DNA通常高水平，肝组织检查无病变或病变轻微[3]，目前指南只建
议慢性乙肝携带者定期随访。

本实验通过检测HBV转基因小鼠和其同系小鼠的血清HBeAg、HBsAg平，尾尖HBV DNA含量，血清转氨酶水平，以及肝组织γ-
干扰素(Interferon-γ，IFN-γ)和白介素-10(Interleukin-10，IL-10)含量，观察扶
正祛毒方对慢性乙肝携带小鼠肝脏炎症、HBV复制以及免疫调节方面的影响，以
期为改善慢性乙肝病毒携带者的预后寻求治疗方案，并初步探讨其作用机制。

1 材料与方法
1.1 动物
SPF级HBV转基因C57BL/6J小鼠30只及其同系小鼠10只，雄性，周龄(6±2)周，体重(20±2)g，由北京大学实验动物科学部提供。

1.2 药物
扶正祛毒方：黄芪30 g、当归15 g、醋柴胡10 g、郁金10 g、蒲公英15 g、半枝莲15 g、白花蛇舌草15 g、炙甘草6 g，剂型为配方颗粒，由北京中医药大学
东方医院制剂中心配制，每剂配方颗粒8 g，加入生理盐水后配制成浓度为0.121 g/mL的药液；根据人和动物体表面积计算公式换算后，按10 mL/(kg·d)灌胃。

阿德福韦酯片(贺维力)由葛兰素史克(天津)有限公司生产，用生理盐水配制成0.2 mg/mL浓度的药液，根据人和动物体表面积计算公式换算后，按8.35 mL/(kg·d)灌胃。

1.3 试剂与仪器
5417R台式低温高速离心机(Eppendorf公司)，AU480全自动生化仪(日本奥林巴斯株式会社)，I2000化学发光免疫分析仪(美国雅培)，Nanodrop little型核酸浓
度测定仪(THERMO公司)，7900 Fast型qPCR仪(Applied biosystems公司)，EPS 300型电泳仪(biorad公司)，2500型凝胶成像仪(biorad公司)。

1.4 动物分组
在适应性饲养2周后，将30只HBV转基因小鼠随机分为3组：模型组、西药组、
中药组，每组10只，同系正常小鼠10只为空白组。

中药组予扶正祛毒方药液10 mL/(kg·d)灌胃，西药组予阿德福韦酯药液8.35 mL/(kg·d)灌胃，模型组、空白组均予生理盐水10 mL/(kg·d)灌胃。

连续灌胃24周，每周称重1次，根据体重调
整各组灌胃剂量。

至24周，各组老鼠死亡情况：模型组3只，西药组2只，中药组0只，空白组0只，其中模型组1只因肝部肿瘤死亡，其余4只均因灌胃误入
气道致死，故本实验按每组7只统计数据。

1.5 检测指标及方法
1.5.1 转氨酶灌胃结束后，眼眶取血法取血，应用全自动生化分析仪测定血清中ALT、AST。

1.5.2 乙肝抗原应用化学发光免疫分析仪测定血清HBsAg、HBeAg水平。

1.5.3 HBV DNA 用剪刀剪取尾尖，运用荧光定量PCR检测分析尾尖中HBV DNA，并通过计算[4]得到HBV DNA相对表达量。

1.5.4 IFN-γ、IL-10 取血后，迅速断颈椎处死小鼠，取肝脏并匀浆，运用ELISA
法检测其IFN-γ、IL-10含量。

1.6 统计学处理
采用SPSS 20.0软件进行数据处理，各组数据均符合正态分布，各项数据以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 各组慢性乙肝病毒携带小鼠血清ALT、AST含量及HBsAg、HBeAg阳性情况ALT、AST：与空白组比较，模型组ALT、AST显著升高(P<0.05)；中药组和西药组显著低于模型组(P<0.05)，且中药组比西药组更低(P<0.05)，差异具有统计学
意义。

结果见表1。

HBsAg：空白组、模型组、西药组、中药组阳性率分别为0%、100%、100%、100%，西药组和中药组HBsAg清除率均为0%(阴性<0.05，阳性≥0.05)。

HBeAg：空白组、模型组、西药组、中药组阳性率分别为0%、100%、71.4%、57.1%，中药组HBeAg阴转率为42.9%，西药组HBeAg阴转率为28.6%(阴性<1，阳性≥1)。

2.2 各组慢性乙肝病毒携带小鼠尾尖HBV DNA荧光定量PCR结果。

应用荧光定量比较Ct值法测定各组小鼠尾尖HBV DNA基因相对表达量均值，发现模型组显著高于空白组(P<0.05)，中药组较模型组显著降低(P<0.05)，差异具有统计学意义。

结果见表2。

表1 各组慢性乙肝病毒携带小鼠血清ALT、AST含量比较组别nALTAST空白组737.29±3.45049.14±7.777模型组762.86±3.436a62.86±5.728a西药组755.00±4.000ab53.43±7.185ab中药组749.86±5.047abc54.14±6.719bc 注：与空白组比较aP<0.05；与模型组比较bP<0.05；与西药组比较cP<0.05。

表2 各组慢性乙肝病毒携带小鼠尾尖HBV DNA相对表达量组别nHBV内参基因△Ct2-△△CtHBV基因相对表达量(以空白组为对照组)空白组
726.9221.125.80b1.00模型组725.2623.002.26a11.60西药组
726.8323.503.33a5.55中药组726.4321.514.92bc1.84
注：与空白组比较aP<0.05；与模型组比较bP<0.05；与西药组比较cP<0.05。

2.3 各组慢性乙肝病毒携带小鼠肝组织中IFN-γ、IL-10表达情况
IFN-γ：与空白组比较，模型组显著降低(P<0.05);与模型组比较，中药组显著升高(P<0.05)。

IL-10：与空白组比较，模型组显著升高(P<0.05)；与模型组比较，中药组显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。

结果见表3。

表3 各组慢性乙肝病毒携带小鼠肝组织IFN-γ、IL-10含量比较组别nIFN-γIL-10空白组7137.929±18.235725.829±9.183模型组
765.688±25.2171a265.16±89.4249a西药组
782.349±44.5191a193.719±85.2048a中药组
797.422±23.7285b47.265±28.6704bc
注：与空白组比较aP<0.05，与模型组比较bP<0.05，与西药组比较cP<0.05。

3 讨论
中医学认为慢性乙肝病毒携带者的病因病机以正虚毒伏为核心，正气亏虚则不能抗邪于外，乙肝疫毒邪气侵袭人体后潜伏于肝脏，伏而不发，日久则痰浊、瘀血、湿热酿生，甚者发为积聚。

扶正祛毒方中黄芪、甘草补益正气，脱毒外出，取其“扶正”之功，白花蛇舌草、蒲公英、半枝莲清热解毒，取其“祛毒”之效；当归、柴胡、郁金活血行气、祛瘀解毒，以通为用，使邪能行而不留，正气得复而不滞。

近年来研究发现免疫耐受是慢性乙肝病毒携带的核心机制，以树突状细胞-T淋巴细胞轴功能紊乱为关键点，这其中th1/th2细胞因子平衡紊乱逐渐受到人们的重视，th1细胞分泌的IFN-γ能够直接抑制HBV DNA复制和蛋白表达，其可能途径为上调2,5,-寡腺甙酸合成酶表达，下调白蛋白、肝细胞核因子4表达[5]、降低HBV mRNA生成等，从而介导非肝细胞损伤的抗病毒作用。

th2细胞分泌的IL-10能够抑制th1细胞细胞因子mRNA转录，拮抗IFN-γ作用，从而使th2细胞占优势，抑制细胞免疫，降低宿主对HBV的清除效率，同时IL-10还能下调
CD80及CD86等协同刺激分子的表达，从而抑制DC的抗原呈递的功能，进一步抑制细胞免疫的激活。

因此，通过检测肝组织中IFN-γ和IL-10含量能够反映宿主的免疫应答情况。

研究表明慢性乙肝病毒携带小鼠IFN-γ表达下降，而IL-10表达升高，导致th2细胞占优势，DC细胞抗原呈递能力减弱，从而引起细胞免疫的低反应状态，导致免疫耐受，最终形成慢性携带。

实验中模型组小鼠IFN-γ降低，IL-10升高。

而扶正祛毒方能明显提高IFN-γ表达，抑制IL-10表达，从而激活细胞免疫，抑制病毒复制，减轻肝脏炎性损伤，为中药防治慢性HBV携带提供了实验基础与理论依据。

参考文献
【相关文献】
[1] SARIN K S, KUMAR M, LAU G K. , et al. Asian-Pacific clinical practice guidelines on the management of hepatitis B: a 2015 update[J]. Hepatol Int, 2016, 10(1): 1-98.
[2] CHRISTOPH H S, MARKUS C. Management of HBV and HB-V/HDV-Associated Liver Cirrhosis[J]. Visc Med, 2016, 32(2): 86-94.
[3] 王贵强, 王福生, 成军, 等. 慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)[J]. 临床肝胆病杂志, 2015, 31(12): 1941-1960.
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